隐孢子虫入侵相关蛋白分子研究进展

孙露露，谢褔杰，李娟锋，边啸坤，王荣军

(河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046)

隐孢子虫属是顶复门的一员，该门还包括其他被广泛认知的属，如疟原虫属(Plasmodium)和弓形虫属(Toxoplasma)等[1]。隐孢子虫感染可引起隐孢子虫病[2]，隐孢子虫属内具有广泛的遗传多态性，目前已鉴定出43个隐孢子虫有效虫种和60多个隐孢子虫基因型[3]。宿主摄入隐孢子虫卵囊后，在胰酶和/或胆汁盐等消化液作用下进行脱囊并释放出感染性子孢子，子孢子在宿主肠上皮细胞进行滑行运动，并借助由微线体(micronemes)、棒状体(rhoptries)和致密颗粒(dense granules)等分泌细胞器组成的顶端复合体入侵宿主细胞[4]。入侵的子孢子在宿主细胞膜下形成纳虫空泡(parasitophorous vacuole，PV)，进而发育为滋养体(trophozoite)并进入裂殖生殖阶段[5]。研究显示，这些分泌细胞器会分泌大量的入侵相关蛋白分子，例如糖蛋白(glycoprotein)、黏蛋白(mucoprotein)等，试验证明多种入侵相关蛋白分子可介导虫体入侵过程[6-8]。针对隐孢子虫顶端复合体蛋白的特异性抗体和抑制剂可以阻断宿主细胞的入侵，目前多数研究均集中于鉴定入侵阶段分泌的相关蛋白分子[9]。

目前国内外对隐孢子虫入侵机制、致病机制以及宿主防御隐孢子虫感染的免疫调控机制的研究虽然取得了一定的进展，但仍需大量深入的研究，以满足开发设计抗隐孢子虫药物和疫苗之所需[10]。本文主要根据寄生虫学者对以下5种隐孢子虫入侵相关蛋白分子的结构和功能的研究做一综述。

1 磷脂酶A2

磷脂酶(phospholipase)是一种以多种形式存在并能够水解甘油磷脂酯键的酶，根据水解位点不同可将磷脂酶分为磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)、磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)、磷脂酶B(phospholipase B，PLB)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)和磷脂酶D(phospholipase D，PLD)[11]。磷脂酶A2家族根据其结构和化学性质不同，可分为分泌型磷脂酶A2(secreted phospholipase A2，sPLA2)、非钙依赖型磷脂酶A2(calcium-independent phospholipase A2，iPLA2)、胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)和脂肪滋养蛋白磷脂酶A2(patatin-like phospholipase A2，PLP)[12]。研究显示，磷脂酶A2为顶复门原虫发病机制中的关键酶，主要与顶复门原虫入侵有关。相关的理论多来自于弓形虫和疟原虫的研究，而在隐孢子虫上的生物学功能研究相对较少[13]。

Pollok R C等[14]通过用特异性分泌型磷脂酶A2抑制剂和抗分泌型磷脂酶A2抗体来检测微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)来源的分泌型磷脂酶A2在促进微小隐孢子虫入侵人肠上皮细胞中的潜在作用。首先利用微小隐孢子虫体外感染人肠上皮细胞系试验，确定微小隐孢子虫来源的分泌型磷脂酶A2活性与幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的磷脂酶A2活性相同，这一结果表明，在微小隐孢子虫入侵阶段存在分泌型磷脂酶A2，并推测其可能在人肠上皮细胞的入侵过程中发挥重要作用。其次用分泌型磷脂酶A2抑制剂(对溴代苯甲酰基溴)预处理微小隐孢子虫子孢子后感染肠上皮细胞，结果显示肠上皮细胞的感染被显著抑制，与未感染组相比，对溴代苯甲酰基溴对肠上皮细胞没有抑制作用，这一结果表明，抑制剂是作用于微小隐孢子虫而不是肠上皮细胞；同时利用蜂毒分泌型磷脂酶A2多克隆抗体阻断微小隐孢子虫感染肠上皮细胞，结果显示微小隐孢子虫对肠上皮细胞的感染也被显著抑制，以上结果表明分泌型磷脂酶A2抑制剂和分泌型磷脂酶A2多克隆抗体可以显著降低虫体的入侵率。最后用意大利蜜蜂(Apismellifera)毒液来源的分泌型磷脂酶A2对微小隐孢子虫子孢子进行预处理，结果显示子孢子对肠上皮细胞的入侵无显著性差异。这一结果支持了微小隐孢子虫来源的分泌型磷脂酶A2在入侵过程中发挥作用。Carryn S等[15]通过体外检测微小隐孢子虫活力和侵染性试验，将单克隆抗体(3E2)单独孵育微小隐孢子虫子孢子，荧光显微镜观察结果显示单克隆抗体(3E2)显著抑制子孢子的附着和入侵，将磷脂酶A2与单克隆抗体(3E2)结合后共同作用于微小隐孢子虫子孢子，观察结果显示磷脂酶A2抑制子孢子的附着和入侵，表明磷脂酶A2可减少微小隐孢子虫活力和侵染性。然而抑制效果没有单独使用单克隆抗体(3E2)强，但无论是单独使用还是与抗隐孢子虫的中和单克隆抗体联合使用，磷脂酶A2都具有作为抗隐孢子虫药物的潜力。

2 Cp2

O'hara S P等[16]通过微小隐孢子虫体外感染人结直肠腺癌细胞(HCT-8)试验检测Cp2特性，根据氨基酸序列结构分析结果显示，Cp2是一种分泌型膜蛋白，利用免疫荧光和免疫电镜观察发现Cp2蛋白在子孢子中富集并始终定位于滋养体和Ⅰ型分裂体的的纳虫空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)上。在微小隐孢子虫的性发育过程中，Cp2蛋白的表达水平更高，表明Cp2是一个在微小孢子虫所有发育阶段都有表达的蛋白。

Lee S U等[17]采用实时荧光定量PCR( real-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法检测微小隐孢子虫Cp2基因作为活性标记的有效性，通过将Cp2基因与热休克蛋白70(70 ku heat shock protein，HSP70)、隐孢子虫卵囊壁蛋白[18]、β-微管蛋白(β-tubulin)和小核糖体RNA(18S rRNA)基因进行比较，结果显示Cp2基因被鉴定为最敏感、最可靠、最准确的候选基因，可作为微小隐孢子虫活性的有效标记。基于这一点，Jenkins M C等[19]利用荧光定量检测微小隐孢子虫在脱囊过程中Cp2蛋白的基因信使RNA(mRNA)的表达水平，结果显示mRNA转录水平出现了高水平的上调，于是推测可能是Cp2蛋白在虫体入侵准备阶段的合成显著增加。随后，Mukerjee A等[20]通过将NP-906(一种纳米抑制剂)与隐孢子虫特异性蛋白Cp2的抗体偶联，以特异性地靶向微小隐孢子虫，和未与Cp2抗体结合的NP-906相比，结果显示Cp2抗体偶联纳米颗粒(Cp2-NP-906)经过预孵育后，细胞培养中的微小隐孢子虫感染水平降低了200倍，而同浓度条件的未与Cp2抗体结合的NP-906使微小隐孢子虫感染水平降低了4.4倍，说明Cp2-NP-906可以显著降低培养细胞中微小隐孢子虫的感染率，表明Cp2抗体对微小隐孢子虫入侵宿主细胞具有一定的阻断作用，从而也证明了Cp2蛋白介导虫体入侵过程。

3 Cpa135

微小隐孢子虫Cpa135蛋白是通过顶端复合体表达和分泌的多结构域抗原蛋白[21]。该蛋白的特征之一是具有LCCL结构域，这也是顶复门原虫中各种分泌蛋白的共同特征。研究显示，LCCL结构域蛋白在微小隐孢子虫子孢子时期表达[22]。蛋白同源性分析结果表明，Cpa135相关蛋白是顶复门原虫LCCL蛋白中一个独特的家族[23]。蛋白组学分析证明微小隐孢子虫在与HCT-8相互作用过程中分泌的蛋白发挥一定的生物学功能[24]。

有研究表明,Cpa135基因可作为识别隐孢子虫感染人类的有效标记[25]。Tosini F等[26]在微小隐孢子虫感染HCT-8细胞试验中，利用RNA印迹法(Northern blot)鉴定出Cpa135的信使RNA(mRNA)；并通过蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定出在脱囊过程中，由Cpa135基因编码的Cpa135蛋白的含量迅速增加，在30 min内明显稳定；最后由荧光定量检测结果显示Cpa135cDNA在24 h和48 h均未检测到荧光信号，而在72 h出现阳性信号，在96 h时信号几乎无法探测到，表明微小隐孢子虫入侵HCT-8细胞后，Cpa135基因持续沉默至48 h，72 h后mRNA的合成再次活跃，Cpa135在HCT-8细胞上的免疫荧光至少连续存在96 h。综上研究结果表明Cpa135蛋白介导微小隐孢子虫入侵过程。

4 CpSUB

类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like proteases，SUB)是属于丝氨酸蛋白酶家族的一种。目前，隐孢子虫类枯草杆菌蛋白酶1(Cryptosporidiumsubtilisin-like proteases 1，CpSUB1)是唯一在微小隐孢子虫中表达的枯草酶。Tomazic M L等[27]的研究结果表明，该酶具有高度的保守性、免疫原性和表达性，并在犊牛感染早期时在体内被识别。

Wanyiri J W等[28]通过微小隐孢子虫体外感染HCT-8细胞试验检测CpSUB1的特性，结果显示在微小隐孢子虫裂解液中存在人呋喃型和蛋白酶活性，其活性可将糖蛋白gp40/15加工裂解成gp40和gp15。Cui Z H等[29]的研究结果显示，抗gp40/15和抗gp40抗体可在体外中和微小隐孢子虫感染，表明gp40/15的特异性抗体可阻断虫体入侵过程。此外，Wanyiri J W等[30]根据荧光定量分析鉴定隐孢子虫CpSUB1蛋白血清以剂量依赖的方式显著抑制隐孢子虫感染HCT-8细胞，表明CpSUB1抗体也可阻断虫体的入侵。除特异性抗体外，该酶的有关抑制剂在虫体入侵过程中也发挥同样的作用。例如，Feng X等[31]利用体外试验检测类枯草菌蛋白酶抑制剂和其他丝氨酸蛋白酶抑制剂对隐孢子虫活性的影响，结果显示微小隐孢子虫的感染的感染率显著降低。Ch Stratakos A等[32]逐渐增加CpSUB1抑制剂(Auranta3001)的剂量后，结果显示微小隐孢子虫感染率呈剂量依赖性降低。不仅CpSUB1的特异性抗体和抑制剂能够达到阻断虫体入侵的效果，而且研究表明，通过诱导CpSUB1的mRNA表达的沉默同样能够减少95%的隐孢子虫从感染的肠上皮细胞中逸出，表明CpSUB1在逸出过程中发挥一定的作用，并提示在这一阶段中断隐孢子虫生命周期也很有可能有效抑制虫体入侵[33]。由此证明，CpSUB1可成为未来研究和开发抗隐孢子虫药物和疫苗的一个潜在靶点。

5 CpMuc

O'connor R M等[34]通过隐孢子虫基因组数据库鉴定出在2号染色体上有7条黏蛋白小序列，将其命名为隐孢子虫黏蛋白(Cryptosporidiummucoproteins，CpMucs)。由于在任何其他顶复门基因组中没有发现同源物，说明这些黏蛋白为隐孢子虫所特有。Paluszynski J等[35]的研究表明隐孢子虫黏蛋白4(Cryptosporidiummucoprotein 4，CpMuc4)可直接与人结肠癌细胞(Caco2A)受体相互作用，并在入侵过程中发挥关键作用。O'connorR M等[34]根据免疫荧光检测结果显示抗CpMuc4抗体和抗隐孢子虫黏蛋白5(Cryptosporidiummucoprotein 5，CpMuc5)抗体均与微小隐孢子虫的顶端区域发生反应，显示出表面暴露的抗原表位，并且具有该抗原表位的抗体在体外抑制微小隐孢子虫的感染，表明黏蛋白CpMuc4和CpMuc5由顶端区分泌，它们的特异性抗体均可阻断子孢子入侵Caco2A的上皮细胞[35]。

6 展望

大量证据表明，隐孢子虫入侵相关蛋白分子介导宿主细胞的入侵过程，并发挥关键作用。目前对隐孢子虫入侵相关蛋白分子的功能研究相对较少，因此针对隐孢子虫入侵相关蛋白，重点解析它们的结构以及与宿主的互作机制将是一个重点研究方向，可以为防治隐孢子虫引起的相关疾病提供重要的参考依据，研究结果也必将为设计开发抗隐孢子虫病药物或疫苗提供新的思路和策略。