食品微生物检测实验室标准菌株的管理和质量控制

2022-11-17郑孝贤王海龙林梦丹方东升

食品安全导刊 2022年11期

詹清，郑孝贤，王海龙，林梦丹，方东升

（福建省微生物研究所，福建福州 350000）

随着人们对食品安全问题的日渐关注，食品微生物检验的市场需求扩大，同时也对检验机构的人员和专业技术手段提出了更严格的要求。标准菌株作为微生物检测工作的关键因素，是检测质量内部控制的一部分[1]。标准菌株是一类遗传学特性已得到确认和保证，并且可溯源的模式菌株，其在培养基和试剂的质量验收、检测方法的确认和证实以及确保检测结果的准确性等各方面都具有不可替代的重要作用[2]。本文结合实验室的检测工作实际，对食品微生物检测实验室标准菌株的日常规范化管理以及质量控制进行探讨。

1 标准菌株的来源

依据《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》（CNAS—CL01-A001：2018）的规定，实验室必须有保藏满足实验需要的标准菌株，除特殊检测方法（如抗菌实验或药敏实验）用到的菌株外，还需具备用于培养基（试剂）验收/质量控制、方法确认/证实、阳、阴性对照、人员培训考核和结果质量的保证等需要的菌株，且标准菌株应该从国际或国家认可的菌种保藏机构购买[3]。目前，我国的微生物检测实验室所用的标准菌株主要来自以下机构，美国典型菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）、中国医学细菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）、中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）和广东省微生物菌种保藏中心（Guangdong Microbial Culture Collection Center，GDMCC）[4]。

2 标准菌株的选择

由于标准菌株种类繁多，同种或同一亚种的不同菌株的某些生物学特性可能会存在一些差别。因此，在选择菌株的时候不仅要注意菌株的名称，还要注意菌株的编号。如铜绿假单胞菌ATCC27853和铜绿假单胞菌ATCC15442二者产生绿脓菌素的能力差异较大。食品微生物检测实验室可根据所开展的检测项目，参照食品安全国家标准GB 4789系列，选择标准规定的菌株作为检测实验的阴、阳性对照[5]。另外，《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）规定了不同种类培养基的质量控制标准，并指定了相应的标准菌株作为质控菌株[6]。

3 标准菌株的验收

实验室收到标准菌株时，首先应核对菌株的数量和名称，同时检查菌株附有的相关资料以及每一支菌株包装的完整性，并在菌株接收记录上登记相关信息，如菌株名称、数量、菌号、来源途径和接收日期等。同时给每支菌株粘贴标签，标签内容包括菌种名称、菌号、代次、接收日期、接收人、贮存条件及有效期至，新购入的原始菌株依照随产品附有的菌株储存方法进行储存。

4 标准菌株的复活、传代及确认

4.1 标准菌株的复活

得到标准菌株后，应尽早进行复活和保藏。在进行复活前，要根据菌株的特性，确定培养基与培养条件。通常从菌种保藏机构购买的标准菌株会附带操作说明，可直接按照说明书进行复活。若没有附带说明书，可通过查阅文献等方式确认菌株营养需求和生长条件。在复活标准菌株时，应严格按照《人间传染的病原微生物名录》《病原微生物实验室生物安全管理条例》《动物病原微生物分类名录》及《实验室生物安全通用要求》（GB 19489—2008）的规定，在相应的生物安全水平下操作。从菌种保藏机构购买的标准菌株通常是冻干粉状态，可选择加入少量生理盐水或复苏液（购买菌株包装中提供），将冻干菌种制成悬浮液，然后用无菌滴管或移液器吸取适量移至固体培养基平板（或液体培养基）中进行培养。

4.2 菌株的性能确认

为了保证标准菌株的质量，菌株经过复活，并在适宜的培养基中生长后，需进行纯度和性能的确认，同时做好确认记录。纯度检查通常采用平板划线法，用无菌接种环将复活后的菌株划线于相应的鉴别平板或非选择平板上，分离出单菌落，观察单菌落形态是否与菌株特征相符。然后取平板上的单菌落进行革兰氏染色，染色结果应符合要求。最后利用生理生化试验鉴定菌株的性能。常见的生化鉴定产品有API生化鉴定试剂盒和标准菌株生化鉴定试剂盒，也可借助全自动细菌生化鉴定仪等仪器进行鉴定。

4.3 菌株的传代

从菌种保藏机构购买回来的标准菌种通常为0代，将0代标准菌株转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株，即标准储备菌株。将标准储备菌株再转接一代即可获得工作菌株，理论上工作菌株传代不超过5代[7]。每次传代需填写传代确认记录表，记录表内容应包括菌株名称、编号、代数、制成代编号、培养基、培养温度及时间、纯度检查过程、镜检、生化鉴定结果和操作者等信息，以保证传代后菌株质量的可控性。制备的菌株应由管理员统一进行标签标识，标签内容包括菌株名称、内部编号、传代日期及有效期等信息。内部编号规则通常采用字母加数字表示，即菌株拉丁文缩写字母+代次+传代日期+顺序号。

5 标准菌株的保藏

菌株保藏的主要目的是为了保持原菌株的活力和特性，降低菌株的变异和污染[8]。一种良好有效的保藏方法要能保持原菌株的优良特性长期稳定，同时操作上还须具备简便性和经济性等特点。食品微生物检测实验室常用的菌株保藏方法有以下几种。

5.1 斜面低温保藏法

将菌株接种在适宜的斜面培养基上，待菌株生长完全后，转至2～8 ℃的冰箱保藏（需常温保存的菌株除外，如铜绿假单胞菌和霍乱弧菌等）。此法常用于工作菌株的保藏，一般可保存3个月左右（不同种类菌株保存周期略有不同）。该方法的优点是操作简便、易推广、存活率高。缺点是保藏周期短、菌株随着传代次数的增加容易发生变异或引入污染。

5.2 液体石蜡保藏法

在斜面保藏法的基础上，加入灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡，垂直放置使石蜡高出斜面顶端l cm，将培养物与空气隔绝，以此达到保藏效果。此方法的优点是操作简单，保存时间长，一般可保存1～2年。缺点是不适用于能分解烃类的菌株保存，且斜面占用空间大。

5.3 甘油悬液保藏法

用灭过菌的甘油（浓度为15%～20%），将新鲜的纯培养物洗脱下来，混合均匀，再分装至菌种保藏管中，置于-20 ℃低温保存，一般可保存1年以上。本方法操作简单，不需特殊设备，不需反复传代，使用方便。

5.4 冷冻真空干燥保藏法

冷冻真空干燥保藏法简称冻干法，它是将需保藏菌株的细胞悬液或孢子悬液与保护剂混合，然后置于安瓿管中，在低温条件下快速冻结，并减压抽真空，使水分升华将样品脱水干燥，制成完全干燥的固体菌块。在真空条件下将安瓿管立即熔封，最后置于低温冰箱保存。此方法的优点是保存周期长，一般可达5年以上，菌株存活率高、变异率低。缺点是该方法操作烦琐，且需要冻干机等专用设备。

6 标准菌株的领用及销毁

食品检测实验室的标准菌株应由专人保管，领用标准菌株、标准储备菌株和工作菌株时要做好交接工作，并填写领用记录表，记录表内容应包括菌株名称、编号、使用日期、用途、使用人和管理人签字确认等。《实验室生物安全通用要求》（GB 19489—2008）规定了生物安全实验室处置废弃物的要求，标准菌株使用完毕后相关污染物品应进行严格的消毒灭菌处理，并记录。

7 标准菌株的期间核查

标准菌株是一类易发生死亡、衰退和被污染的标准物质[9]。为确保标准菌株相关生物学性能的稳定，微生物检测实验室应制定详细的标准菌株期间核查计划，对菌株核查的方法、频次、文件记录、结果判定等方面内容进行合理规定。实验室可根据工作实际情况对保存的标准菌株进行核查，主要包括文件的核查和标准菌株纯度、活性、稳定性和生化特性等指标的核查[10]。文件核查的主要工作是查阅菌株档案以及相关记录的完整性，包括菌株溯源证明、标准菌株台账、传代及确认记录和领用及销毁记录等。标准菌株纯度、活性、稳定性和生化特性的核查可参考菌株的性能确认方法，一般情况下，菌株性能的期间核查与常规标准菌株的确认方法和依据基本一致，但期间核查可从多方面使用不同的方法进行，并不局限于单一的方法。