植物根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1菌株生物学特性比较研究

杨晓玫, 冯 起, 吕丹彤, 姚 拓, 李 琦, 谢华山

(1.中国科学院西北生态环境资源研究院内陆河流域生态水文重点实验室， 甘肃 兰州 730000； 2.甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 3.草业生态系统教育部重点实验室， 甘肃 兰州 730070； 4.中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)特性，是指促生菌适宜的生长环境以及突出的特性，能反映促生菌保藏前后的稳定性[1]。植物根际促生菌的特性(如生长速度、遗传稳定性、营养价值以及抗病性大小等)能直接决定菌株的利用价值和工业开发。菌株生长速率较快，容易培养和开发，能提高工业化的生产效率；菌株遗传稳定性高，能增加工业化生产的稳定性和可操作性；菌株营养价值较高，能降低培养成本，降低其产品的经济价值；菌株抗病性强，能有效抵御病原菌的入侵，阻止杂菌的污染[2]。PGPR具有促进植物的生长，抑制植物病原菌繁殖，改善植物根际微生态，降低土壤污染物含量等作用，其常被制成生物菌肥(菌液)替代或部分替代化肥和农药的使用，能有效改良土壤及防止土壤退化[3-4]。对优良根际促生菌的研究，需评价菌株稳定性，不能针对单一突出特性片面研究。

植物根际促生菌的合理保藏是后期研究的基础，其主要目的是使筛选得到的优良菌株减少杂菌污染、变异、死亡，降低微生物菌株的新陈代谢，减缓促生菌的生长，并使菌株保持良好的活性[5]。不同的保藏时间，菌株的生长速率等生物学特性不同，保藏方法不恰当及保藏时间过长，菌株的生长速率会出现一定程度的降低[6-8]，故对促生菌株活性和稳定性的检测尤为重要。低温冷冻斜面保藏通过控制菌株生长的温度、湿气及氧气等，抑制微生物的生长代谢活动，使菌株的生长繁殖处于休眠状态，其代谢处于最低水平，不易产生生产能力退化现象，并保持菌株自身的生物学特性[9]。针对不同的菌株类型有不同的保藏方法，保藏后菌株的生物学特性需进行比较研究，变化趋势低的方可进行后期的研究和开发利用[10-11]。

PGPR是一类优良植物根际促生菌，因其突出的特性被大量开发为微生物菌肥或微生物菌剂等，但促生菌特性可能会因为保藏时间过长或菌株的稳定性差等原因发生改变，直接影响菌株后续研究的正确性[12-14]。前期的研究已经证实BacillusmycoidesGnyt1菌株有优良的开发潜力[15]，目前针对芽孢杆菌保藏前后生物学特性的基础研究和芽孢杆菌的分子生物研究鲜有报道，因此，本文以保藏两年后的BacillusmycoidesGnyt1菌株为研究材料，再次测定其菌株的特性，参照保藏前BacillusmycoidesGnyt1菌株的特性指标，检测BacillusmycoidesGnyt1菌株特性的稳定性，以期为后续BacillusmycoidesGnyt1菌株比较基因组学和功能基因等方面的深入研究提供理论依据和可靠的保障。

1 材料与方法

1.1 材料

研究菌株BacillusmycoidesGnyt1是2014年分离自天祝高寒草地优势植物珠芽蓼(Polygonumviviparum)根际的一株优良根际促生菌[12]，低温冷冻斜面保藏于甘肃农业大学草业学院草地微生物多样性实验室。2017年本课题组测定发现其生物特性表现突出稳定性较高[15]，对照菌株Gm92，426，89，93等均为课题组前期研究中积累的优良菌株材料，均为低温冷冻斜面保藏，其特性见表1。菌株保藏2年后，对其生物学特性进行测定。

表1 对照菌株的功能特性Table 1 Features of the benchmark

1.2 方法

1.2.1菌株保藏 菌株保藏采用低温冷冻斜面保藏法，试管中配制LB固体斜面培养基，待冷却凝固后用无菌接种针接种已培养好的菌株，采用S型分别在试管LB固体斜面培养基上划线，置于-20℃冷冻冰箱隔离保藏，间隔60天重复此方法活化并置冰箱保藏。

1.2.2菌株生长曲线测定 分别使用两步法活化菌株，即Luria-Bertani(LB)固体培养基(pH=7)第一次活化，次日转入LB培养液(pH=7)28℃ 180 r·min-1培养24 h左右，至菌株的OD600相同。采用平板涂布法每隔4 h取样1 mL培养液，等间隔取样至72 h，测定不同时间及不同时期的菌株活菌的数量，分析数据并绘制菌株生长曲线。

1.2.3菌株对pH的适应能力测定 分别配置pH为4，5，6，7，8，9的LB液体培养基，不同菌株分别等量接种于不同pH培养液中，28℃条件培养48 h，测定菌株OD600值及有效活菌数，分别涂布于固体培养基计算有效活菌数，并对比分析不同pH对不同菌株生长的影响。

1.2.4菌株对温度耐受性的测定 分别使用两步法活化菌株，即LB固体培养基(pH=7)第一次活化各菌株，次日转入LB培养液28℃ 180 r·min-1培养24 h左右，至菌株的OD600相同进行测定。取1 mL菌株培养液转接至LB液体培养基(pH=7)中，设置未转接菌株培养液为空白对照，分别置于4℃，8℃，12℃，16℃，20℃，24℃，28℃，32℃，36℃，40℃恒温培养32 h，32 h后取样测定菌株OD600及有效活菌数，分析不同温度对菌株生长的影响。

1.2.5菌株溶磷特性的测定 菌株溶磷特性的测定采用钼蓝比色法，配制150 mL蒙金娜液体培养基和PKO液体培养基，使用无菌接种针分别依次将菌株接种至液体培养基中，28℃180 r·min-1培养14 d，取出5 mL上清液，4℃ 10 000 r·min-1离心10 min，加至45 mL 0.5 mol·L-1NaHCO3中，继续加入1 g无磷活性碳粉，震荡后过滤，分别取相同的过滤液，加入显色液，测定其吸光值并依据公式计算菌株磷含量[2]

公式如下：

在上式中，ρ代表溶液中的磷含量，单位为μg·mL-1；V代表待测液的体积，单位为mL；Ts代表分取的倍数；V0代表所取的待测菌株培养液的体积，单位为mL。

1.2.6菌株固氮特性的测定 菌株固氮特性的测定采用乙炔还原法，均以固氮酶活性表示，以nmol(C2H4)·h-1·mL-1为单位，具体试验方法如下：配制NFM半固体培养基，放入灭菌西林瓶中，培养基中分别接入待测菌株，塞入纯棉透气塞封口，28℃恒温培养48 h后将纯棉透气塞换为橡胶密封塞，培养数分钟，使用无菌针管抽出1 mL空气，继续注入等体积乙炔，密封置于28℃恒温箱中培养48 h，最后用气相色谱法分别测定培养后瓶内混合气体中乙炔的浓度大小，根据公式计算出各菌株的固氮酶活性[2]：

公式中，N表示待测菌株的固氮酶活性，单位为nmol(C2H4)·h-1·mL-1；Hx代表测出的乙炔的峰面积；C为最后培养后混合气体中乙炔的浓度，单位为nmol·mL-1；V代表所选用的西林瓶的容积，单位为mL；Hs代表标样乙炔的GC峰面积；t代表待测菌株培养的时间，单位为h；24.9表示标准C2H4气体在测试时的体积(mL)[1]。

1.2.7菌株分泌植物激素(吲哚乙酸(Indole acetic acid，IAA))特性的测定 菌株分泌植物激素(IAA)特性采用HPLC法测定。具体试验方法如下：配置LB液体培养基，分别接入待测菌株，28℃恒温条件180 r·min-1暗培养72 h，随后分别将培养液低温10 000 r·min-1离心15 min，无菌离心管中收集离心所得的上清液，加入至活化好的SPE柱内，10%甲醇淋洗，80%甲醇洗脱，采用氮气吹干法浓缩洗脱液，参考刘婷等[12]的色谱条件，使用HPLC法依次检测。

1.2.8数据处理与分析 采用Excel 2010整理数据，软件SPSS 19.0进行单因素方差分析，多重比较采用新复极差法(Duncan)，显著性水平设为0.05，数据表示为“均值±标准差”，采用Sigmaplot 10.0软件进行统计作图。

2 结果与分析

2.1 菌株生长动态的测定

菌株的生长曲线反映了菌株在培养生长过程中繁殖和衰退的规律，菌株在适宜的条件下培养，会有延滞期、对数期、稳定期和衰退期4个时期。图1为研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和4株对照菌株的生长曲线。所有菌株从各自培养基接至新配好的培养液中均有适应期，主要表现为菌株生长比较缓慢，以适应不同的新环境，不同菌株的适应期很接近。在接种第12 h以后，菌株均能迅速繁殖，进入对数生长期，各菌株的菌体迅速增长。但菌株的类型不同，进入对数期的生长速率不相同，表现为不同菌株24 h菌株生长量不相同，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1在24 h对数期的生长速率最高，证明其增殖速率最快。所有菌株培养至36 h～48 h，均缓慢进入稳定生长期，所有菌株在60 h之后慢慢进入衰亡期。菌株类型不同则生长速率不相同，本研究中菌株BacillusmycoidesGnyt1和对照菌株Ensifermeliloti93的生长速率高于其余三株菌。

2.2 菌株最适pH的测定

不同的pH值变化会直接影响菌株的生长速率。由图2可知，在生长环境pH低于4时，菌株均不生长。在生长环境pH高于4时菌株开始慢慢生长，菌株活性较低，研究菌株和对照菌株之间的差异不明显。在生长环境pH达到5时，所有菌株开始生长，不同的菌株有一定的差异，菌株Ensifermeliloti93生长最缓慢，Ensifermeliloti426和Bacillussubtilis89菌株次之，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和Pseudomonassp. Gm92生长状况最佳。在菌株生长环境pH为6～7时，对照菌株Pseudomonassp. Gm92，Bacillussubtilis89和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的生长速率达到最高值，而菌株Ensifermeliloti426和菌株Ensifermeliloti93达到最大生长率的环境pH值为8。在菌株生长环境pH超过9时，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和对照菌株Pseudomonassp. Gm92生长速率逐渐下降，其他菌株的生长速率下降，菌株生长环境pH继续增加时，所有菌株停止生长。综上所述，本文的研究菌株BacillusmycoidesGnyt1 pH耐受性高，pH 4～9均能生长，最适的生长pH在6～7之间。

2.3 菌株最适温度的测定

菌株适宜的生长环境温度是决定菌株正常生长的关键因素之一。由图3可知，在生长温度为4℃时各菌株均未生长，在生长温度为16℃时各菌株生长缓慢且生长速率不同，其中研究菌株BacillusmycoidesGnyt1生长速率最高。生长温度至28℃时，各菌株生长速率均增长，其中以研究菌株BacillusmycoidesGnyt1生长最好。在生长温度为34℃～40℃时，除研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和对照菌株Pseudomonassp. Gm 92以外的菌株生长速率随温度的增高而降低，说明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1具有很强的温度耐受性。在温度到达40℃以上，所有菌株的生长明显受到抑制。综上所述，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1具有很强的温度耐受性，8℃～40℃均能正常生长，但研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的最适生长温度为28℃～34℃。

图3 菌株生长温度曲线Fig.3 Strain growth temperature

2.4 菌株的溶磷能力

溶解无机磷的菌株，会伴随生长不断产酸，酸性环境下菌株能将无机磷溶解为有效磷。如图4所示，五株菌株均具有溶磷能力，不同的菌株溶解无机磷的能力不同，菌株有效磷含量越高说明菌株的溶磷能力越高。其中菌株Bacillussubtilis89和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1溶磷能力最好，有效磷含量分别为324.49 μg·mL-1和285.17 μg·mL-1，显著高于菌株Pseudomonassp. Gm92和菌株Ensifermeliloti426 (P<0.05)，菌株Ensifermeliloti426的溶磷能力最低，有效磷含量为55.42 μg·mL-1。结果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1溶磷能力较高，可继续作为研究菌株深入研究溶磷机理和溶磷功能基因。

图4 菌株的溶磷能力Fig.4 Phosphate dissolving ability of the strain注：不同小写字母表示同一指标不同菌株表达量差异显著(P<0.05)。下同Note:Different lowercase letters indicate that the expression levels of different strains of the same index are significantly different (P<0.05). The same as below

2.5 菌株的分泌植物激素能力

菌株BacillusmycoidesGnyt1和四株对照菌株Ensifermeliloti93,Pseudomonassp. Gm92,Ensifermeliloti426和Bacillussubtilis89保藏后的分泌植物激素的能力如图5所示，五株菌株均有分泌植物激素IAA的能力，其中菌株Ensifermeliloti426、菌株Ensifermeliloti93和研究菌株BacillusmycoidesGnyt1分泌植物激素IAA能力较高，显著高于菌株Pseudomonassp. Gm92和菌株Bacillussubtilis89 (P<0.05)，对照菌株Bacillussubtilis89的分泌植物激素IAA能力最低。结果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1分泌植物激素IAA能力较高，能继续作为研究菌株进行后续的深入研究。

图5 菌株的分泌植物激素能力Fig.5 Strain producing ability of the strain

2.6 菌株的固氮能力

研究菌株BacillusmycoidesGnyt1和四株对照菌株保藏后的固氮酶活性如图6所示，其中，研究菌株BacillusmycoidesGnyt1固氮酶活性最高，显著高于其他四株对照菌株(P<0.05)，对照菌株Bacillussubtilis89次之，菌株Ensifermeliloti426固氮能力最低。结果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1固氮能力最强，可继续作为研究菌株深入研究固氮机理和固氮功能基因。

图6 菌株固氮酶活性Fig.6 Strain nitrogenase activity

3 讨论

生长速率高、培养温度适中、培养条件便于调控、pH适中及生物安全性高、稳定性高的菌株可进行开发利用[17-18]。保藏前菌株BacillusmycoidesGnyt1最适生长温度为28℃～36℃，最适pH为7～8，增殖速度快，其溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力相比课题组前期研究积累的优良菌株更为突出[15,19]。本研究表明，与菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前的特性以及和课题组积累的优良对照菌株相比，菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏后生长动态、最适pH及最适温度均无明显变化，研究菌株能高效的溶解无机磷，固氮能力最高且分泌植物激素(IAA)的能力较强，特性稳定性高，综合评价表明菌株BacillusmycoidesGnyt1仍为优良促生菌株，可以进一步开发利用和深入研究。研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的高稳定性，可能与菌株宿主植物生长在高寒环境有关，能抵抗环境的变化[20]。适宜的菌株保藏可以促进优良菌株资源库的发展，且特性突出的菌株遗传稳定性较高，传代培养或保藏后退化不明显，不影响菌株的开发利用，这一结果与胡江春研究中的结果相似[21]。对植物促生菌的功能进行研究，必须要对比测定特性的变化，保证后期研究材料的正确性和有效性。因此，植物促生菌的生长动态、pH值、温度以及突出特性的研究对选育菌株和保藏菌株均有重要的评价作用。

优良植物根际促生菌通常具有溶磷、固氮或分泌植物激素的一种或多种突出生物功能[24]，溶磷菌不代表只能溶磷，可能也有固氮功能[22]，其中测定菌株固氮酶活性的高低是确认菌株固氮能力的传统方法，能直接反映菌株固氮能力强弱[23]，菌株传代保藏使菌株固氮能力产生些许退化属于正常现象。因此，选育良好的多功能菌株，必须要全方面衡量菌株，合理的保藏菌株对后期研究颇为重要，能评价菌株的后续可利用性及保藏方法的可行性[25-26]。本研究菌株BacillusmycoidesGnyt1使用低温冷冻斜面保藏方法，保藏后菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、固氮能力和分泌植物激素能力均较高，说明低温冷冻斜面保藏的方法可行，但此方法不适合长期保藏。菌株保藏的方式多种，而适合细菌科学有效的保存方法有低温冷冻斜面保藏和甘油冷冻保藏，甘油冷冻保藏适合多年及以上的长期细菌菌株的保藏，短期及菌株的活化多用低温冷冻斜面保藏方法[27-30]。

植物根际促生菌因其优良的生物学特性，成为近年来研究的热点[31-32]。菌株的溶磷能力、分泌植物激素能力和固氮能力会随菌株的生长时间而发生一定程度的降低，降低程度的大小根据菌株的类型、生长时间和保藏方法的差异而不同[33]。菌株的长期有效利用需对比其他优良促生菌的生物学特性，通过比较确定菌株的优势[34]，决定是否有后期利用的潜力。本研究选取菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前测定生物性能的对照菌株及同类型的优良菌株作为对照菌株，综合比较研究菌株和对照菌株的生物性能，其中研究菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力均显著高于4株对照菌株，其功能丰富、特性优良，仍为优良菌株，这与菌株BacillusmycoidesGnyt1保藏前相比对照菌株测定生物性能的结果一致[15]，保证了后期研究选择该菌株的可靠性和合理性。比较保藏前后的菌株BacillusmycoidesGnyt1的生物学特性，除菌株生长动态、最适pH及最适温度无变化外，菌株BacillusmycoidesGnyt1的溶磷能力、分泌植物激素能力及固氮能力降低均不显著，符合菌株保藏的降低范围，这与秦婷婷等[35]的微生物保藏研究结论一致，合理适宜的菌株保藏方法能避免不良因素的影响，能使优良菌株的特性稳定保存，可提供优良稳定的菌株供后期分子生物学等研究的研究材料。

4 结论

本研究将保藏两年后的菌株BacillusmycoidesGnyt1与四株优良植物促生菌进行比较，结果表明研究菌株BacillusmycoidesGnyt1特性稳定性较高，增殖速度最快，活菌浓度最高，对环境pH有很强耐受性，最适pH值在6～7之间，对环境温度耐受性高，最适生长温度为28℃～34℃。其溶磷能力、固氮能力及分泌生长激素的能力均较强，保藏两年后仍可继续作为研究菌株深入研究其功能机理和功能基因。