四川泡青菜发酵过程中特征香味物质演变规律研究

张杰，徐飞，詹军，夏金川，赵志峰*，蒋茜，王佐军

(1.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065；2.四川李记乐宝食品有限公司，四川 眉山 620036；3.四川李记酱菜调味品有限公司，四川 眉山 620030)

泡青菜是四川泡菜中的一种，其风味浓郁醇香、酸爽可口，是川菜制作的必备佐料。原料青菜经腌制发酵后产生的香味物质可以减轻其原有的辛辣刺激味，产生适宜的辛辣味，并赋予泡青菜独特风味。泡青菜的发酵过程是香味物质种类和数量不断演替变化的过程，泡青菜特有风味的产生是多种香味物质相互作用的结果。现已有学者对泡菜发酵过程中香味物质的组成做了研究，例如：姚英政[1]采用气相色谱-质谱联用仪对不同腌制时期(原料、发酵1年、发酵2年、发酵3年)的冬菜进行了香味物质分析，研究发现不同时期的发酵冬菜中共检测出70种香味物质，其中，在不同发酵时期样品中均检测出的香味物质成分有3种，分别为苯乙醇、异硫氰酸烯丙酯和苯甲醛。张华芳等[2]对腌制7，14，21，28 d泡菜的香味物质进行研究，共检测出92种，当腌制至成熟过程时，酯类、酸类、醇类和腈类物质含量均有所增加，而烃类、醛类物质含量呈现下降趋势。四川泡青菜的传统制作需要经历6个月以上，有时受货物积压的原因，发酵时间甚至超过1年，在此发酵周期内，泡青菜的风味变化十分明显；而现有研究大多脱离了工业生产实际，取样间隔过短或过长，不能真实地反映出工业化泡菜发酵周期内香味物质的演变规律。

本研究以工业化四川泡青菜为研究对象，采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)联用技术对发酵18个月内的产品进行香味物质研究，为四川泡菜的风味研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

发酵时间为0个月(即泡青菜原料)、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、15个月和18个月的泡青菜样品，编号分别为0M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M、10M、11M、12M、15M和18M，均取自四川李记酱菜调味品有限公司。

1.1.2 仪器

BMS-220分析天平 上海卓精电子科技有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司；GCMS-QP2010 SE气相色谱-质谱联用仪 日本Shimadzu公司；DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色谱柱 美国Agilent公司；SPME手动进样装置(包括SPME手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头(24Ga,3pk)) 美国Supelco公司。

B

A

1.2 实验方法

1.2.1 香味物质的提取

参考汪冬冬等[3]的研究方法并加以修改。准确称取5.00 g泡青菜样品，切碎后加入样品瓶中，盖好后置于40 ℃恒温水浴30 min，将已活化好的萃取头插入瓶中，推出纤维头，使之与样品保持1.5 cm的距离，萃取温度40 ℃，萃取时间15 min。待萃取结束后抽回纤维头，拔出萃取头，再将萃取头插入GC进样口，推出纤维头，于250 ℃条件下解吸5 min，抽回纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器并采集实验数据。

1.2.2 香味物质的鉴定

色谱条件：HP-5MS弹性毛细管柱(30 m×0.125 mm×0.125 μm)；载气：氮气，不分流进样；流速为1 mL/min；柱温程序升温：初始温度为40 ℃，保持3 min；从40 ℃升到130 ℃，速率为5 ℃/min，而后在130 ℃保持5 min；从130 ℃升到155 ℃，速率为25 ℃/min，然后从155 ℃升到220 ℃，速率为5 ℃/min，在220 ℃保持5 min，进样口温度为240 ℃。

质谱条件：离子源温度220 ℃；电子能量70 eV，传输线温度220 ℃；接口温度280 ℃，扫描范围(m/z)：50～550。

1.3 数据处理与分析

将所测香味物质的质谱信息与数据库中已知香味物质的质谱信息进行比对，根据相似度的高低进行定性；再根据被测化合物占所有化合物总色谱峰面积之比，来计算被测组分的相对含量。所得香味物质定性、定量结果采用Origin 9.1软件进行绘图，最后采用SPSS 25.0软件对主体香味物质进行聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 不同发酵时期泡青菜香味物质的对比分析

续 表

表2 不同发酵时期泡青菜香味物质种类的变化

研究表明，四川泡青菜中的香味物质有三大来源：一是泡菜原料，包括蔬菜和香辛料本身的香味物质，如蒜中的硫丙醛-S-氧化物[4]、萝卜中的醇类和萜类[5]、芥菜中的异硫氰酸烯丙酯[6]；二是乳酸菌发酵产生的香味物质，如乙酸、丁酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、乙烯、丁二醇、乙醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯等[7]；三是其他菌群的发酵作用产生的香味物质，如醋酸菌、酵母菌等[8]。

不同发酵时期泡青菜的GC-MS图谱见图1。香味物质的种类和相对含量变化对比见图2。

图1 不同发酵时期泡青菜香味物质的总离子流图

由图1和图2可知，通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术共检测出8类共计285种香味物质。泡青菜原料主要香味物质种类为烃类和酯类，发酵1～5个月的泡青菜主要香味物质种类为醇类和酯类，发酵6～9个月的泡青菜主要香味物质种类为烃类和酯类，发酵10～11个月的泡青菜主要香味物质种类为烃类和醇类，发酵12～18个月的泡青菜主要香味物质种类为烃类和酮类。发酵18个月期间，烃类、酮类和酯类具有较为明显的变化趋势，具体表现为随着发酵时间的延长，烃类和酮类物质相对含量增加；酯类物质分为含硫的氰酸酯类和其他短链脂肪酸酯类，氰酸酯类主要来源于原料本身，在泡青菜未成熟时产生辛辣味[9]，相对含量占比最高，在发酵9个月时由于氰酸酯类被酶和微生物分解，因而辛辣味逐渐减弱，而其他短链脂肪酸酯类增加；但是当发酵时间延长至18个月时，无论是氰酸酯类还是其他短链脂肪酸酯类相对含量均显著下降。

2.2 不同发酵时期泡青菜主体香味物质分析

根据不同发酵时间泡青菜中各类香味物质的含量(见图3)，采用系统聚类树法将样品进行聚类分析，不同发酵时期主体香味物质相对含量的变化情况见表3。

图3 不同发酵时期泡青菜聚类分析图

表3 不同发酵时期泡青菜主体香味物质相对含量变化

由图3可知，当设定距离为10时，整个发酵周期内的泡青菜可以分为8个发酵阶段，其中0～3个月为第一阶段，4个月和5个月分别为第二、三阶段，6～7个月为第四阶段，8～9个月为第五阶段，10～12个月为第六阶段，15个月和18个月分别为第七、八阶段。根据聚类分析结果并结合表1不同时期香味物质种类总相对含量和表3主体香味物质相对含量变化情况可知，整个发酵周期内的泡青菜可以分为5个不同阶段，即发酵前期0～5个月，发酵中前期6～9个月，发酵中后期10～12个月，发酵后期15个月，发酵末期18个月。

表1 不同发酵时期泡青菜香味物质相对含量的变化

发酵前期0～5个月，泡青菜原料(0个月)中主体香味物质有2种，分别为异硫氰酸烯丙酯和异硫氰酸环丙酯，相对含量分别为9.06%和75.33%；原料中异硫氰酸酯类含量高，随着发酵的进行，异硫氰酸酯被酶和微生物分解，使蔬菜原料中的辛辣味逐渐减弱。发酵1个月时增加了乙醇和乙酸，乙醇和乙酸的产生是由于微生物的作用，是微生物的代谢产物[10]。发酵第2，3，4，5个月时，主体香味物质种数越来越丰富，主体香味物质酯类中的异硫氰酸酯类相对含量不断下降，这可能是随着发酵时间延长，芥子苷酶的活性在此阶段急剧下降，异硫氰酸酯类等酶解产物的含量也相应地下降；同时，在乳酸菌等微生物的发酵作用下，整个体系的 pH 值不断下降，在 pH 降低的情况下，芥子苷在芥子苷酶的作用下主要生成其他化合物。即发酵前期0～5个月，主要呈现浓郁醇香和辛辣味。

发酵中前期6～9个月，从主体香味物质组成上分析，6个月和7个月的泡青菜共有主体香味物质最多，共有组分分别为α-姜黄烯、β-倍半水芹烯、姜烯、1-甲基-4-(1-亚甲基-5-甲基-4-己烯基)环己烯、(+)-2-Carene、桉叶油醇、异硫氰酸烯丙酯和乙酸芳樟酯，α-姜黄烯、姜烯和β-倍半水芹烯是姜黄精油的主要香味物质，属于萜烯类化合物，普遍易挥发，阈值低[11]；桉叶油醇有樟脑气息和清凉的草药味道[12]；异硫氰酸烯丙酯具有催泪作用，适量地存在可赋予泡青菜特有的芥辣味[13]；乙酸芳樟酯具有类似薰衣草、铃兰等的幽雅香气[14]。除此之外，发酵6个月的泡青菜还含有乙酸乙酯，具有果香的酒香味[15]；发酵7个月的泡青菜还含有(E)-β-金合欢烯，主要存在于甜玫瑰油、橙油和桔子油等中。发酵8个月和9个月的泡青菜共有的主体香味物质只有3种，分别为姜烯、丙二醇和乙酸芳樟酯；发酵8个月的泡青菜特有的主体香味物质为β-倍半水芹烯和三醋酸甘油酯；发酵9个月的泡青菜特有的主体香味物质为乙酸和异硫氰酸烯丙酯。发酵6～9个月时，泡青菜已逐渐趋于成熟，以烃类和酯类物质为主要香型贡献者，呈现浓郁花果香、较淡辛辣味。

发酵中后期10～12个月的泡青菜共有的主体香味物质为α-姜黄烯、(E)-β-金合欢烯、姜烯、1-甲基-4-(1-亚甲基-5-甲基-4-己烯基)环己烯、(+)-2-Carene、桉叶油醇、Tumerone、乙酸和二硫化碳；发酵10个月的泡青菜特有的主体香味物质为丙二醇、Ar-tumerone和异硫氰酸烯丙酯，发酵11个月特有的主体香味物质为β-倍半水芹烯和异硫氰酸烯丙酯，发酵12个月特有的主体香味物质为β-倍半水芹烯、Ar-tumerone和乙酸乙酯。当发酵10～12个月时，发酵酸香逐渐增强，此时以烃类、酮类和酸类物质为主要香型贡献者，呈现浓郁花果香和发酵酸香，以及较淡辛辣味。

发酵后期15个月泡青菜的主体香味物质种类为α-姜黄烯、β-倍半水芹烯、4-蒈烯、姜烯、芳姜黄酮、Tumerone、丁酸和异硫氰酸环丙酯。发酵末期18个月泡青菜的主体香味物质种类为α-姜黄烯、β-倍半水芹烯、姜烯、Cyclohexene, 4-methyl-3-(1-methylethylidene)-、桉叶油醇、芳姜黄酮、Tumerone、丁酸、异硫氰酸环丙酯和硫脲。当泡青菜发酵时间延长至15个月和18个月时，不再因为发酵时间的延长，风味向好，泡青菜发酵15个月香型的贡献者为烃类和酮类，泡青菜发酵18个月香型的贡献者为烃类和其他类。发酵后期(15个月)和发酵末期(18个月)的泡青菜均主要呈现浓郁花果香及微微辛辣味和发酵酸香。

综上所述，泡青菜发酵前期(0～5个月)主体香味物质主要以醇类和酯类为主，呈现浓郁醇香和辛辣味；发酵中前期(6～9个月)主体香味物质为烃类和酯类，呈现浓郁花果香、较淡辛辣味；发酵中后期(10～12个月)主体香味物质为烃类、酮类和酸类，呈现浓郁花果香和发酵酸香，以及较淡辛辣味；发酵后期(15个月)主体香味物质为烃类和酮类，发酵末期(18个月)主体香味物质为烃类和其他类，发酵后期和发酵末期的泡青菜均主要呈现浓郁花果香及微微辛辣味和发酵酸香。随着发酵时间的延长，烃类、酮类物质呈增加趋势，酯类、醇类物质呈下降趋势。

3 结论

使用HS-SPME-GC-MS解析了14个不同发酵时间四川工业化泡青菜中的香味物质变化，最终共检测出8类，285种香味物质，其中有26种为主体香味物质，相对含量大于5%。并结合聚类分析发现，发酵18个月的泡青菜可以分为5个发酵阶段，即发酵前期0～5个月、发酵中前期6～9个月、发酵中后期10～12个月、发酵后期15个月、发酵末期18个月。并且α-姜黄烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合欢烯、姜烯、乙醇、桉叶油醇、芳姜黄酮、乙酸、异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸环丙酯、异硫氰酸异丁酯、乙酸乙酯和乙酸芳樟酯，对泡青菜的风味形成有重要贡献。泡菜类发酵产品一直有“发酵时间越久，越香”的说法，但根据本研究结果来看，当处于发酵后期时，其香味物质的种类及含量并非越来越好，本研究的成果或许可以为泡青菜生产企业改良生产方式、提高企业效益提供一定借鉴。