离子色谱-电导法检测液体乳中的硫氰酸根

邹沫君

乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）

硫氰酸根为无色、易挥发、具有强烈气味的酸性液体，有毒。其毒性主要由其在体内释放的氰根离子而引起，氰根离子在体内能快速与细胞色素氧化酶中的三价铁离子结合，抑制该酶活性，使组织不能利用氧，引起恶心、呕吐、腹痛、腹泻等肠道功能紊乱，血压波动，心率减慢，重度中毒可致肾功能明显损害，慢性毒性可抑制碘的运转和甲状腺激素合成，恶化碘缺乏症[1-3]。自然界中也含有硫氰酸根，硫氰酸根被认为是哺乳动物血液中一种常见的电解质，在动物、人体组织和分泌物中都能检测到，属于防御系统的一部分，如在初乳和患乳房炎奶牛的乳中浓度较高，是对硫代糖苷（葡糖异硫氰酸盐）和生氰糖苷脱毒处理的一种产物，因此牛乳中本身含有硫氰酸根[4-6]。有文献研究发现加入微量的硫氰酸盐和过氧化氢（分别约为12 mg/L和8.5 mg/L），会在牛奶中获得较好抗菌的乳过氧化物酶（LP）体系活动，可作为一种牢靠的抑菌保鲜方法用于保存冷却过的或未冷却过的生奶[7-9]。

近几年来食品安全事故频繁发生，有些不法奶户为了延长原料乳的保质期，人为加入硫氰酸根作为生牛奶保鲜剂，使其成为掺假物质之一[10-12]。我国加大对食品安全方面的工作力度，2008年发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中明确规定乳及乳制品中硫氰酸盐属于违法添加物质，不可以作为乳及液态奶的添加剂[13-15]。

此次研究探索建立了梯度淋洗-电导检测液体乳中硫氰酸根的离子色谱法，试样用乙腈沉淀蛋白，上清液加水稀释并经固相萃取柱净化后，用阴离子交换色谱柱IonPac AS 19分离，电导检测器检测，测定液体乳中硫氰酸根的含量，旨在对液体乳中硫氰酸根快速灵敏的检测提供参考，达到有效监控液体乳中硫氰酸根含量的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

液体乳（市售）；硫氰酸根SCN-标准品（1 000 μg/mL，Lot Number P2-SCN675949，Inorganic Ventures）；乙腈（色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司）；实验室用水为超纯水（电阻率18.25 MΩ·cm）。

1.2 仪器与设备

Thermo ScientificTMICS-1100离子色谱系统、Dionex OnGuard RP小柱（1.0 mL，Thermo SCIENTIFIC公司）；TGL-16台式高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；UVS-3涡旋混合仪（北京优晟联合科技有限公司）；STAR星系列超纯水机（上海砾鼎水处理设备有限公司）；0.22 μm水系PES虑膜（颇尔公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

分析柱IonPac AS 19分离柱（250 mm×4 mm，Thermo SCIENTIFIC公司）及IonPac AG 19保护柱（50×4 mm，Thermo SCIENTIFIC公司）；淋洗液源（带有CR-ATC的EGC II KOH）。梯度淋洗条件：0～18.0 min，50 mmol/L KOH；18.1～23.0 min，70 mmol/L KOH；23.1～25.0 min，50 mmol/L KOH；检测器采用电导检测；抑制器ASRS ULTRA II 4 mm，自循环电抑制，电流124 mA；流速1.0 mL/mm；柱温30 ℃；定量环500 μL。

1.3.2 标准溶液的配制

准确移取一定量的硫氰酸根SCN-标准品，用水逐级稀释成质量浓度分别为0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80和1.00 μg/mL的标准工作溶液。在1.3.1的色谱条件下进行测定，以硫氰酸根SCN-质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制硫氰酸根SCN-峰面积-质量浓度标准曲线。

1.3.3 试样制备

1.3.3.1 提取

准确称取4.0 g（精确至0.01 g）试样于25 mL离心管中，加入5 mL乙腈，涡旋混匀，常温下沉降10 min。在10 000 r/min转速下离心5 min，取上清液备用。

1.3.3.2 净化

取1 mL上述备用的上清液，用水稀释定容至10 mL，混匀后依次通过0.22 μm水系进口聚醚砜PES滤膜，OnGuard RP小柱除去试样中的脂肪，进样检测。OnGuard RP小柱使用前依次用5 mL甲醇和10 mL纯水活化，放置20 min后备用。

2 结果与分析

2.1 试样前处理条件的选择

液体乳中含有大量蛋白质、脂肪等大分子物质，需要在进入色谱柱之前除去，否则会被吸附在柱内，不易洗脱，导致柱效急剧下降。常用去蛋白的方法有酸沉降、盐沉降、有机溶剂沉降等方法。根据经验，试验选用牛奶-乙腈（4∶5，V/V）沉降蛋白，沉降时间10 min，效果显著。涡旋振摇提取法提高硫氰酸根SCN-提取率，依次通过0.22 μm水系滤膜、OnGuard RP小柱，利用共价吸附作用，捕获残余的大分子有机物，减少对色谱柱的污染。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

液体乳中常含有多种营养成分，因此在测定其中硫氰酸根时，需要选用柱容量较高的分析柱。IonPac AS 19离子色谱柱是Dionex在聚合物键合技术方面的新进展，用高容量树脂（柱容量60 ueq，240 ueq；粒径7.5 μm）优化柱子对硫氰酸根的选择性，确保在使用抑制性电导检测的情况下，即使存在超高浓度的其他阴离子，也能通过使用KOH梯度实现对低浓度硫氰酸根的定量测定。同时，这种聚合物亲水性非常好，对KOH淋洗液选择性很好，可以使用较高浓度的淋洗液。因此选用IonPac AS19作为分析柱，对硫氰酸根的分离具有时间短、分离度高、峰形对称等优点。

2.2.2 淋洗液系统选择

CO32-型和OH-型是离子色谱分析阴离子常用的2种淋洗液。其中，在色谱分析中应用范围最广的为CO32-型，但因其经抑制器转化后为碳酸，碳酸部分电离出碳酸根离子与氢离子，导致背景电导较高，水负峰较大，灵敏度降低，需要对试样进行浓缩等前处理，不适合大体积直接进样与梯度淋洗。然而，OH-型淋洗液克服上述不足，在线产生系统电解水生成高纯KOH，经抑制器转化为水，没有碳酸盐污染，具有较小的水负峰与较高的灵敏度，可以得到较好的保留时间重现性与较低检出限。因此，选择OH-型体系。

2.2.3 淋洗液浓度选择

淋洗液浓度的选择关系到待测组分SCN-与试样中无机阴离子的分离效果评价及出峰时间的确定。硫氰酸根是易极化阴离子，疏水性强，在阴离子交换柱上保留相对较强，因此一般情况下需要浓度较高的淋洗液进行梯度淋洗，才能得到更好的效果。试验选择50 mmol/L KOH进行等度淋洗，待SCN-出峰后，使用高浓度70 mmol/L KOH淋洗液冲洗5 min分析柱，将吸附在柱上的强保留性物质洗脱下来，经平衡回到起始浓度。因此选用50～70 mmol/L KOH梯度淋洗作为试验条件，既克服试样中基体离子的干扰，又大幅缩短SCN-保留时间，实现其迅速完美分离。

2.2.4 流速和柱温耐受性考察

分别考察采用不同流速及柱温进行测定时色谱行为的变化，如表1所示，以硫氰酸根质量浓度计，不同流速条件下SRSD值为0.67%，不同柱温条件下SRSD值为0.71%。结果表明，在实际检测过程中色谱条件（流速及柱温）有微小变化时，硫氰酸根含量测定条件较宽，结果基本不受影响，系统具有较好的耐受性。

表1 系统耐受性考察结果

2.3 色谱行为

经试验探索，综合考虑硫氰酸根保留时间及峰分离度等因素，最终选用1.3.1的色谱条件，实现液体乳中硫氰酸根的准确定量。硫氰酸根标准溶液、阴性试样溶液及阴性加标试样溶液色谱图见图1。结果表明，该方法选择性高，分离效果好，加标试样出峰良好。

图1 硫氰酸根标准溶液（A）、阴性试样（B）及阴性加标试样（C）色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、方法检出限和定量限考察

取硫氰酸根系列标准工作溶液，按1.3.1中色谱条件进样，以硫氰酸根峰面积对质量浓度计算线性回归方程，确定相关系数。比较硫氰酸根色谱信号峰与基线信号，确定仪器最低检出限（S/N=3），按试样制备过程，得出方法检出限与定量限，结果见表2。结果表明，硫氰酸根在0.0～1.0 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 9），且该方法检出限低（0.069 μg/g），能完全满足分析检测要求。

表2 硫氰酸根的回归方程、相关系数、最低检出限、定量限

2.4.2 方法精密度考察

取0.1 μg/mL硫氰酸根标准溶液，在上述条件下重复进样6次，计算其相对标准偏差（SRSD），结果见表3。结果表明，硫氰酸根的保留时间和峰面积SRSD分别为0.23%和0.74%，表明其精密度较好。

表3 方法精密度试验（n=6）

2.4.3 稳定性考察

取制备好的液体乳供试品溶液，按1.3.1的色谱条件每间隔4 h进样1次，测定硫氰酸根质量浓度，结果见表4。结果表明，稳定性试验SRSD值为1.42%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

表4 稳定性试验结果（n=7）

2.4.4 回收率考察

分别精密称取3份液体乳试样，加入低（0.1 μg/mL）、中（0.2 μg/mL）、高（0.6 μg/mL）3种质量浓度的硫氰酸根标准溶液。按上述方法提取、净化后，进行色谱分析，对每个添加水平做3次平行试验，计算各组分的平均回收率及其SRSD值，以考察方法的准确性，结果见表5。结果表明，硫氰酸根的平均回收率在93.55%～98.06%范围内，SRSD值为0.89%～1.18%，方法重现性及准确度良好，符合分析检测要求。

表5 加标回收率试验结果（n=3）

2.5 实际试样分析

利用试验所建立的方法，对市面上几款液体乳饮品中硫氰酸根进行测定，结果见表6所示。结果表明，该方法对这些试样均具有良好的适用性，色谱无干扰，不同品牌液体乳饮品中硫氰酸根本底含量存在一定差异。

表6 试样分析结果

3 结论

试验建立离子色谱法测定液体乳中硫氰酸根的方法。试样经乙腈沉降蛋白，涡旋振摇提取，固相萃取小柱净化，以IonPac AS19阴离子交换色谱柱分离，50～ 70 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性电导检测。该方法分离效果良好，操作简便，灵敏度高，精密度、准确度均能满足实际检测工作要求，值得推广应用。