热处理对鱿鱼上清液中氧化三甲胺降解的影响

杨美竹，王慧森，刘璇，马春颖，李双燕，2，鄂旭，王鑫，李颖畅*

(1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013)

秘鲁鱿鱼(Dosidicusgigas)又称美洲大鱿鱼，集中分布在东部太平洋的秘鲁海域[1]。鱿鱼中含有大量的氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)和多种与呈味有关的氨基酸，TMAO是水产品中纯天然的鲜味成分[2-3]。但是鱿鱼中的甲醛(Formaldehyde, FA)是强致癌、致畸物质，严重影响了鱿鱼制品的品质和食用安全[4]。目前，国内外研究表明，鱿鱼中内源性甲醛的产生途径主要有两条：一是酶催化途径，二是非酶途径生成[5]。Lin等[6]研究发现将5种鱿鱼在 200 ℃的条件下加热 1 h 后，鱿鱼体内大部分的 TMAO热分解生成了二甲胺(Dimethylamine, DMA)和三甲胺(Trimethylamine,TMA)。付雪艳等[7]表明加热过程可促进鱿鱼中甲醛的生成。并且已有的研究表明，氧化三甲胺通过高温裂解产生甲醛的现象仅在鱿鱼加工过程中比较普遍和显著。靳肖等[8]通过确立简单的TMAO非酶作用反应模型体系以TMAO和Fe(Ⅱ)为反应物，与鱿鱼丝提取的上清液进行比较。结果发现，随着温度的升高，TMAO热分解反应越剧烈，但当加热30 min后FA和DMA的生成量逐渐呈现稳定的趋势。

通过测定反应前后鱿鱼上清液中FA、DMA、TMA生成量的变化、氨基酸和还原糖含量的变化，研究不同的反应条件对鱿鱼上清液中TMAO热分解的影响，探究鱿鱼体内含有的氨基酸和还原糖与TMAO降解的相关性，找出加热前后变化较为显著的内源性氨基酸和还原糖，为进一步研究内源性氨基酸和还原糖对TMAO热分解的影响奠定了基础，且为鱿鱼中甲醛含量的控制提供了理论依据，促进了水产品行业的发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

秘鲁鱿鱼：购于锦州市林西路水产市场；甲醇(色谱纯)：购于上海吉至生化科技有限公司；无水硫酸钠：购于上海迈瑞尔化学技术有限公司；三羟甲基氨基甲烷：购于天津博迪化工股份有限公司；对甲苯磺酰氯：购于江苏新鑫隆医药科技股份有限公司；甲苯(色谱纯)：购于北京市通广精细化工公司；氯化铁：购于嵘汇创新科技有限公司；以上无特殊说明均为分析纯。

1.2 主要实验仪器

UV-2550紫外-可见分光光度仪 日本岛津仪器公司；冷冻高速离心机 美国Thermo公司；7890高效气相色谱仪、高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；电子分析天平 Mettler Toledo公司；PHS-C型pH计 北京赛欧华创科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鱿鱼上清液的提取

将冷冻储藏的鱿鱼在室温下解冻，将鱿鱼表面的皮去掉后用绞肉机绞碎，称取2.00 g鱼肉于50 mL离心管中，加入20 mL 7.5% TCA，冰浴超声30 min，静置10 min沉淀蛋白后，以10000 r/min高速离心10 min，取上清液，用1 mol/L NaOH调pH至6左右，定容至50 mL，冰浴冷却至室温，测定FA、DMA、TMA和TMAO的含量。

1.3.2 温度对鱿鱼上清液中TMAO热分解的影响

取10 mL鱿鱼上清液分别于60，70，80，90，100 ℃条件下反应30 min后迅速冷却，以 5000 r/min离心15 min，测定TMAO、FA、DMA、TMA含量、紫外吸光度和褐变程度。

1.3.3 时间对鱿鱼上清液中TMAO热分解的影响

取10 mL鱿鱼上清液，于100 ℃条件下分别反应0，15，30，45，60，75 min后，迅速冷却，以5000 r/min离心15 min后，测定TMAO、FA、DMA、TMA含量、紫外吸光度和褐变程度。

1.3.4 TMAO、FA、DMA、TMA、紫外吸光度和褐变程度的测定

TMA的测定参考朱军莉[9]的方法。TMAO含量的测定：先取2 mL的反应液，加入1%的三氯化钛溶液0.25 mL，在80 ℃水浴锅中水浴90 s，将TMAO还原为TMA，取出冷却后测定方法同TMA。DMA的测定参考贾佳[10]的方法。

FA的测定参考励建荣等[11]建立的高效液相色谱法。

紫外吸光度和和褐变程度的测定参考Ajandouz等[12]的方法。将反应后的溶液稀释100倍，分别在294 nm和420 nm处测吸光度。

1.3.5 氨基酸含量的测定

按GB/T 5009.124-2003[13]规定的方法进行测定。

1.3.6 还原糖含量的测定

还原糖的测定参照赵凯等[14]建立的方法。

2 结果与分析

2.1 温度对鱿鱼上清液中TMAO降解的影响

在不同的加热温度条件下鱿鱼上清液中TMAO、FA、DMA、TMA含量的变化情况见图1。

图1 加热温度对鱿鱼上清液中TMAO降解的影响Fig.1 Effect of heating temperature on TMAO degradation in squid supernatant

由图1可知，随着加热温度的升高，TMAO含量显著(P<0.05)降低，同时FA、DMA、TMA含量显著(P<0.05)升高，加热温度对TMAO的降解具有显著影响(P<0.05)。当温度大于70 ℃时，FA、DMA和TMA的含量增加迅速，分别从4.85，69.87，10.54 mg/L增加至29.55，224.71，48.49 mg/L。相应的TMAO含量下降，从最初的1986.88 mg/L下降到1190.2339 mg/L。加热到100 ℃后，FA含量增加了6.09倍，DMA含量增加了3.22倍，TMA含量增加了4.6倍，TMAO含量减少了40.1%。付雪艳等[15]研究发现FA在130 ℃条件下加热60 min后仍有上升的趋势。韩冬娇等[16]研究表明随着贮藏温度的升高，南美白对虾中TMAO含量降低，TMA含量随温度升高增长速度变快。本文的研究结果与其是一致的。

2.2 时间对鱿鱼上清液TMAO降解的影响

在100 ℃的条件下经不同加热时间处理后氧化三甲胺、甲醛、二甲胺和三甲胺含量的变化情况见图2。

图2 加热时间对鱿鱼上清液中TMAO降解的影响Fig.2 Effect of heating time on TMAO degradation in squid supernatant

由图2可知，随着反应时间的增加，TMAO降解速率加快，含量显著(P<0.05)降低，甲醛、二甲胺、三甲胺的生成量随着加热时间的增加呈上升的趋势。加热时间在0～45 min内TMAO热分解生成的FA、DMA和TMA含量迅速升高，与初始含量相比分别增加了7.13倍、7.2倍和4.16倍；随后在45～75 min之间，FA、DMA和TMA的含量增加缓慢，但是100 ℃的条件下加热75 min的过程中TMAO热分解反应仍在进行。靳肖等研究发现鱿鱼丝在100 ℃的条件下加热0～60 min后TMAO热分解变化显著，FA、DMA生成量增加显著，本实验结果与其研究的结果一致，说明加热时间是影响TMAO降解生成FA、DMA和TMA的重要因素。

2.3 时间对鱿鱼上清液褐变程度的影响

在100 ℃的条件下加热不同时间后鱿鱼上清液褐变程度的变化情况见图3。

图3 加热时间对鱿鱼上清液褐变程度的影响Fig.3 Effect of heating time on the browning degree of squid supernatant

由图3可知，随着加热时间的延长，鱿鱼上清液的褐变程度呈现持续增大的趋势，鱿鱼上清液在420 nm和294 nm处的初始吸光度值分别为0.028和0.511，加热75 min后吸光度值分别增加到0.068和0.906，较初始吸光度值分别增加了0.04和0.415，随着加热时间的延长，吸光度值变大，颜色加深。褐变程度增加的原因可能是在加热过程中加热时间越长，鱿鱼上清液中含有的氨基酸和还原糖之间发生的美拉德反应越剧烈，吸光度值越高，褐变越显著。

2.4 温度对鱿鱼上清液褐变程度的影响

在不同加热温度下加热相同时间后鱿鱼上清液褐变程度的变化趋势见图4。

图4 加热温度对鱿鱼上清液褐变程度的影响Fig.4 Effect of heating temperature on the browning degree of squid supernatant

由图4可知，随着加热温度的升高，鱿鱼上清液的褐变程度呈现持续增大的趋势，鱿鱼上清液在420 nm和294 nm处的初始吸光度值分别为0.062和0.163，在加热60～100 ℃的过程中吸光度值分别增加到了0.089和0.255，较初始吸光度值分别增加了1.44倍和1.56倍。在60～70 ℃之间褐变程度不显著，这是因为在该温度范围内对鱿鱼上清液中的氨基酸和还原糖所发生的美拉德反应进行得比较缓慢，褐变程度变化相对不明显。吴惠玲等[17]研究发现糖和氨基酸在大于80 ℃条件下发生的美拉德反应明显，本实验结果显示在80～100 ℃之间鱿鱼上清液的褐变程度显著(P<0.05)。

2.5 加热前后氨基酸的变化

鱿鱼上清液在100 ℃的条件下加热60 min后氨基酸含量的变化情况见表1。

表1 加热前后鱿鱼上清液中氨基酸含量的变化Table 1 The changes in amino acids＇ content in squid supernatant before and after heating

由表1可知，秘鲁鱿鱼上清液中总氨基酸含量为94.61 g/100 g，其中以谷氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸的含量最高，Fu等在对鱿鱼热处理过程中物理化学性质变化的研究中发现，加热前以谷氨酸和脯氨酸的含量最高。随着加热温度的升高，17种氨基酸的含量均呈下降的趋势。当在100 ℃下加热60 min后，赖氨酸含量从最初的9.93 g/100 g下降到6.37 g/100 g，减少率为35.85%；谷氨酸含量由16.47 g/100 g下降至10.58 g/100 g，减少率为35.76%；精氨酸含量由2.25 g/100 g下降至1.32 g/100 g，减少率为41.33%，其中以赖氨酸含量变化最大，加热前后存在显著性差异(P<0.05)。Tsai等[18]研究发现，在所有的氨基酸中Lys对美拉德反应最敏感，褐变率也最高。鱿鱼中含有丰富的蛋白质和氨基酸[19]，鱿鱼在加热的过程中氨基酸含量的显著减少很可能是由于氨基酸参与了美拉德褐变反应。

2.6 加热前后还原糖的变化

加热前后鱿鱼上清液中还原糖含量的变化情况见表2。

表2 加热前后鱿鱼上清液中还原糖含量的变化Table 2 The changes in reducing sugars＇ content in squid supernatant before and after heating

由表2可知，随着加热的进行，半乳糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖含量呈下降的趋势，除半乳糖以外，另外几种还原糖在加热后因含量<10 mg/L而未检出。加热后半乳糖含量从最初的353.23 mg/L下降到了260.72 mg/L。还原糖含量降低的原因可能是鱿鱼在加热的过程中体内含有的还原糖和氨基化合物之间发生了美拉德反应，并且随着加热温度的升高，美拉德反应进行的速率逐渐加快，从而使得还原糖含量呈现下降的趋势[20]。

3 结论

鱿鱼上清液随着温度的升高和加热时间的延长，TMAO逐渐热分解为甲醛、二甲胺和三甲胺。加热温度越高、加热时间越长，TMAO的分解速度越快，相应的FA、DMA和TMA含量也就生成的越多。

鱿鱼上清液中氨基酸含量非常丰富，其中以赖氨酸、谷氨酸、半胱氨酸含量最高。随着加热温度的升高，大部分氨基酸含量呈下降趋势；但鱿鱼上清液中半乳糖的含量较高，经加热处理后乳糖含量显著降低，麦芽糖、葡萄糖、果糖均因含量过低而未检出。

加热温度和加热时间对鱿鱼上清液的褐变程度具有显著变化。温度越高、加热时间越长，鱿鱼上清液的褐变程度越显著，这是因为在加热处理的条件下易发生美拉德反应，产生褐变物质，导致鱿鱼上清液的褐变程度加深。