APP下载

乳清对马苏里拉奶酪成熟过程中蛋白质降解的影响

2022-01-11张荣荣白芳芳原倩倩于钰杰李坤学马玲

中国调味品 2022年1期
关键词:马苏乳清酪蛋白

张荣荣,白芳芳,原倩倩,于钰杰,李坤学,马玲

(山西农业大学 食品科学与工程学院,山西 晋中 030600)

马苏里拉奶酪是Pasta Filata(拉伸型)的一种。这类奶酪在制作过程中都要经历一个独特的热烫拉伸过程,从而使它们具备纤维状的蛋白结构以及融化拉丝的功能特性[1]。马苏里拉奶酪的做法是将水牛乳与奶牛乳混合制成混合乳,并在制作后期将凝结好的奶酪凝块放入热水中热烫,并对奶酪团进行拉伸,从而形成具有拉丝性和弹性的奶酪。热烫拉伸使得奶酪凝块具有良好的延展、拉伸能力,赋予其独特的口感与特点。与其他品种的奶酪相比,马苏里拉奶酪不但具有与其他普通奶酪相同的营养成分,在营养上具有低胆固醇、低卡路里、低碳水化合物、高活性物质含量的特点[2]。

西方国家因其干酪市场发展较为成熟,所以更为重视乳清的回收和再利用,并且对乳清的再利用能力也取得了较大的发展[3],主要是将乳清进行脱盐并分级干燥后制作乳清粉和乳清蛋白粉,也有利用乳清进行发酵制作乳酸。而国内有报道开发乳清饮料或将乳清作为配料制作糕点等。有关直接将乳清通过加热浓缩并制作乳清奶酪的报道较多[4],还有将乳清酸化后制作奶酪的报道,也有将乳清和牛奶混合制作乳奶酪的报道[5-7],此外,有报道在奶酪制作过程中添加乳清蛋白对其品质的影响[8-9],还有报道加入乳清蛋白、大豆蛋白对奶酪成熟过程中品质的影响[10-13]。但随着奶酪市场的不断扩大,如何合理利用乳清成为亟待解决的问题。总体来说,目前我国乳清的再利用和相关产业尚处于起步阶段,回收乳清并对其进行再利用的产业相对不成熟,市面上功能性明确、技术含量较高的乳清蛋白质保健品较少[14],可将乳清用于其他行业的产品的技术较为匮乏,还不能实现高效、多种类的乳清回收再利用和大规模生产。

制作马苏里拉奶酪过程中排出的副产物乳清,除含有乳清中本含有的基本营养成分外,仍保留一部分制作奶酪时必需的凝乳酶,同时乳清中含有乳清蛋白、矿物质等营养物质,具有极高的经济价值和营养价值[15]。本课题通过在奶酪制作过程中加入乳清制作乳清奶酪,以不添加乳清奶酪为对照,通过探究成熟期内添加乳清后的奶酪与不添加乳清的奶酪酸度、蛋白含量的变化,以及成熟期内蛋白降解程度和氨基酸含量的差异,分析添加乳清对奶酪的影响,为丰富马苏里拉奶酪的制作工艺以及对奶酪中乳清的再利用提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

发酵剂:Streptococcussalivariussubsp.thermophilus(唾液链球菌嗜热亚种)CH9;Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus(保加利亚乳杆菌德氏亚种)LB;凝乳酶(活力 1∶150000 U):丹尼斯克(中国)有限公司;鲜牛乳:购于当地牧场,各项指标符合要求;乳清:奶酪副产物;食盐:购于太谷家家利超市。

1.2 主要试剂

三氯乙酸、硫酸锰、硫酸镁、硫氰酸钾、硝酸银、冰醋酸、硼酸(均为分析纯):购自天津市申泰化学试剂有限公司;醋酸钠、硫酸铁铵:天津市博迪化工有限公司;无水硫酸铜、P-磷酸甘油二钠:天津市津北精细化工有限公司;盐酸、硫酸钾:天津市致远化学试剂有限公司;硫酸、硝酸:成都市科龙化工试剂厂;氢氧化钠:北京华腾化工有限公司;抗坏血酸:天津市恒兴化学试剂制造有限公司;聚山梨酯-80:上海江莱生物科技有限公司;乙醇:天津市盛淼精细化工公司;氯化钠:上海华星化工厂。

1.3 主要仪器设备

KDN-08消化炉 上海新嘉电子有限公司;VORTEX-5漩涡混合器 其林贝尔仪器制造有限公司;LD5-2B低速离心机 北京雷勃尔医疗器械有限公司;BVPJ-500TS真空包装机 艾博科技有限公司;238-10超净工作台 苏州苏净集团;凯氏定氮装置 上海精密仪器有限公司;BS224S电子分析天平 北京赛多利斯仪器有限公司;CM-5全自动色差仪 日本Konica Minolta公司;ST2100实验室pH计 奥豪斯仪器有限公司;HH-S8电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;DHG-9243BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造公司;DYY-6C型电泳仪 北京六一生物科技有限公司;L-8900氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.4 实验方法

1.4.1 马苏里拉奶酪的制作

新鲜牛乳→标准化→杀菌(63 ℃,30 min)→冷却(至42 ℃)→添加发酵剂(0.5%,体积比)→加凝乳酶(3‰,体积比,1%食盐水配成1%溶液)→凝乳(30 min)→切割(1.7 cm3立方块)→排除乳清(pH值6.3)→堆酿(42 ℃,1 h)→加1.7%的盐进行揉和→热烫、拉伸(90 ℃,8%食盐水)→冷却(常温)→真空包装→成熟(4 ℃,90 d)。

添加乳清的马苏里拉奶酪的制作除在加入凝乳酶之前加入原料乳体积25%的乳清,其他工艺与马苏里拉奶酪的制作工艺相同。

1.4.2 pH值的测定

pH的测定:取4 ℃预储样品1 g置于研钵内,加蒸馏水10 mL,研磨后用pH计测定[16],测定3次取平均值。

1.4.3 水分活度的测定

将样品切成细碎的小颗粒,使用水分活度仪直接测定[17],测定3次取平均值。

1.4.4 色泽的测定

使用CM-5全自动色差仪测定,指标以亨利系数表示[18],测定3次取平均值。

1.4.5 蛋白质含量的测定

参考GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法测定。

1.4.6 pH 4.6可溶性氮(pH 4.6 SN)的测定

测定方式溶液配制、结果计算参考刘金博的方法[19],测定3次取平均值。

1.4.7 12%三氯乙酸溶液中可溶性氮(12% TCA-SN)的测定

参考Bertola N C等的方法[20],测定3次取平均值。

1.4.8 SDS-PAGE凝胶电泳

本实验主要是用SDS-PAGE凝胶电泳的方法来确定不同奶酪样品中蛋白质的相对质量范围,并对其进行分离。将奶酪样品用水研磨溶解后,将溶液的蛋白含量调整为2 mg/mL,加入样品缓冲液、β-巯基乙醇混合均匀并加热煮沸(目的是加强SDS与蛋白的结合)[21],煮后立即放入冷水中将其冷却,冷却后加入0.05%溴酚蓝20 μL,将混合液振荡均匀,取10 μL混合溶液进样。浓缩胶电压 100 V,分离胶电压 150 V,电泳完成后将凝胶放入固定液中固定,然后用考马斯亮蓝G250染色,染色结束后进行脱色。

1.4.9 游离氨基酸的测定

奶酪游离氨基酸水溶液的提取方法、氨基酸自动分析仪的分析条件均参照GB 5009.124-2016进行测定。

2 结果与分析

2.1 不同奶酪成熟期内pH值的变化

由图1可知,对照奶酪在0 d时的pH值为6.48,当成熟期达到90 d时,pH值为5.77。乳清奶酪在成熟期0 d时的pH值为6.44,当成熟期达到90 d时,pH值为5.60。整体来看,无论是对照奶酪,还是乳清奶酪,在成熟期内的pH值均呈现出下降的趋势,在成熟期内pH下降主要是奶酪中乳酸菌在发酵过程中产生大量乳酸,致使pH值下降。另外,在成熟过程中奶酪中微生物与奶酪中凝乳酶降解脂肪并产生脂肪酸也是导致成熟期奶酪pH下降的原因[22]。0~30 d内两种奶酪的pH值均处于较高的水平,这是因为前期乳糖代谢有限,致使其成熟初期pH值仍较高。0~30 d内乳清奶酪的pH下降幅度小于对照奶酪,其原因是乳清奶酪的蛋白含量高于对照奶酪,在凝乳酶和微生物作用下分解出碱性氨基酸,而60 d后,随着微生物对乳清的利用和发酵作用的增强,导致乳清奶酪的pH下降幅度更大。

图1 不同奶酪成熟期内pH值的变化Fig.1 The changes in pH values of different cheese during maturation

2.2 不同奶酪成熟期内水分活度的变化

由图2可知,对照奶酪和乳清奶酪在奶酪的成熟期间水分活度总体呈下降趋势。在成熟期0~30 d区间内,水分活度的降低程度大,随后水分活度的减少幅度逐渐放缓,且在奶酪成熟过程中的任何时期,乳清奶酪的水分活度均高于对照奶酪。成熟90 d时,对照奶酪的水分活度减少了2.3%,乳清奶酪的水分活度减少了2%。

图2 不同奶酪成熟期内水分活度的变化Fig.2 The changes in water activity of different cheese during maturation

成熟末期的奶酪相较于初期,内部水分含量大幅减少,水分活度也会因此降低。其原因从微观来看,是成熟过程中脂肪与蛋白质在微生物及酶的作用下不断降解,导致化学键断裂,此时脂肪与蛋白质的降解产物与内部游离水结合形成新的结构,游离水含量势必降低,该现象的出现直接导致了水分活度的降低[23]。宏观来讲,因马苏里拉奶酪加工时进行的热烫处理会导致奶酪中形成细小的空洞,导致水分蒸发,造成水分流失,致使水分活度降低。而后下降幅度放缓是因为随着成熟时间的延长,奶酪表层逐渐硬化,形成了一层外壳,阻止其内部水分继续蒸发,因此在成熟后期,奶酪的水分活度下降趋势明显放缓[24]。乳清奶酪总体水分活度高于对照奶酪,是由于在奶酪制作过程中,乳清奶酪将一部分乳清添加进奶酪中,致使乳清奶酪相较于对照奶酪水分活度更高。

2.3 不同奶酪成熟期内色泽的变化

由图3可知,对照奶酪与乳清奶酪的L*值在成熟期0~30 d内均呈现大幅度下降的趋势,表明奶酪的亮度下降。在成熟期30~90 d内,对照奶酪与乳清奶酪的L*值趋于稳定,且在同成熟期内,乳清奶酪的亮度明显高于对照奶酪。成熟期内奶酪的L*值不断减小,主要原因是成熟期内奶酪中蛋白质的水解作用,使奶酪内部的酪蛋白胶粒结构强度下降,进而导致光在奶酪中的反射与散射能力变得很弱。胶粒结构强度的下降使得原本包裹在胶粒结构中的脂肪分子渗透出来,并在渗透出来的脂肪分子中脂溶性色素的作用下,导致奶酪的亮度下降。因乳清奶酪整体蛋白质含量高于对照奶酪,所以乳清奶酪的亮度要高于对照奶酪。

图3 不同奶酪成熟期内L*值的变化

在图4可知,在0~30 d的奶酪成熟期内,对照奶酪与乳清奶酪的b*值均出现了大幅度的下降。而后在30~60 d的奶酪成熟期中,两种奶酪的b*值呈上升趋势,且乳清奶酪的b*值上升幅度明显高于对照奶酪的b*值上升幅度。而后在60~90 d内,b*值的变化趋势趋于稳定。总体来看,除成熟期30 d外,乳清奶酪的b*值整体高于对照奶酪。且两种奶酪的b*值整体呈现先下降后上升最后趋于稳定的变化趋势。奶酪的b*值在成熟期间先减小后增大,主要是因为成熟前期奶酪中蛋白、脂肪等种类物质间发生了相互作用,致使奶酪的质地趋于均匀,进而导致奶酪的黄度下降。在奶酪成熟时间变长的过程中,加速了奶酪中蛋白质的水解,包裹于酪蛋白网状结构内部的脂肪随着结构强度的下降脱离出来,所以黄度上升。同一成熟期,乳清奶酪的蛋白降解程度高于对照奶酪,原先包裹在酪蛋白胶束结构中的脂肪分子较对照奶酪中脂肪分子的渗透量更多,导致乳清奶酪的黄度高于对照奶酪。

图4 奶酪成熟期内b*值的变化Fig.4 The changes in b* values of different cheese during maturation

2.4 不同奶酪成熟期内蛋白质的变化

2.4.1 不同奶酪成熟期内总氮含量的变化

由图5可知,对照奶酪的初始总氮含量为26.34%,乳清奶酪的初始总氮含量为28.64%。30 d时乳清奶酪的总氮含量下降至27.33%,对照奶酪的总氮含量下降至25.43%,60 d时两种奶酪的总氮含量均出现了小幅度的增加,当奶酪成熟期达到90 d时,两种奶酪的总氮含量小于初始值。总体来看,两种奶酪在0~90 d内总氮含量的变化呈现先下降而后小幅度上升的趋势,且整个成熟期内乳清奶酪的总氮含量明显高于对照奶酪(P<0.05)。这种现象的出现主要是乳清奶酪在制作时添加了一部分乳清,而乳清中含有乳清蛋白,所以其蛋白总量要高于对照奶酪。

图5 不同奶酪成熟期内总氮含量的变化

2.4.2 pH 4.6可溶性氮和12%三氯乙酸可溶性氮

在奶酪成熟过程中,奶酪中的凝乳酶、奶酪中微生物产生的内源酶及其他外部因素共同作用使奶酪中的蛋白质发生水解,其程度通过pH 4.6可溶性氮的变化进行描述。

pH 4.6可溶性氮(SN)的组成物质主要为大分子肽类,大分子肽是成熟过程中酪蛋白在凝乳酶、奶酪中乳酸菌产生的蛋白分解酶以及血纤维蛋白酶共同作用下生成的。故可溶性氮受奶酪中凝乳酶添加量及其活性的影响,能够直观地体现出蛋白的降解,奶酪的成熟度由其水溶性氮与总氮之比来体现,因此,pH 4.6可溶性氮可作为奶酪成熟情况的重要考察指标[25-28]。 12%三氯乙酸可溶性氮(TCA-SN)为小肽和氨基酸类的氮,反映奶酪成熟过程中蛋白降解的程度。

由图6可知,对照奶酪与乳清奶酪在成熟期内的pH 4.6可溶性氮随着成熟时间的增加呈上升趋势,其中乳清奶酪在成熟期内pH 4.6可溶性氮含量均高于对照奶酪,其原因可能是乳清奶酪添加的乳清内含有凝乳酶,与奶酪制作时添加的凝乳酶协同作用,促进了蛋白质的水解,且乳清本身营养物质含量高,能够为奶酪中微生物的生长繁殖提供帮助,可以促进奶酪中微生物的生长代谢,进而有利于对蛋白质的降解,使得成熟期内任何时期乳清奶酪的pH 4.6可溶性氮含量均高于同时期对照奶酪的pH 4.6可溶性氮含量。

图6 不同奶酪成熟期内pH 4.6 SN含量的变化

由图7可知,在整个成熟期内,乳清奶酪与对照奶酪的12% TCA-SN含量均呈现上升趋势,在成熟后期,上升趋势放缓,且在任意成熟时间内,乳清奶酪的12% TCA-SN含量均高于对照组奶酪,其变化趋势与乳清奶酪和对照奶酪总氮含量、pH 4.6可溶性氮含量的变化趋势相吻合,乳清奶酪相较于对照奶酪有更高的蛋白含量,另外乳清奶酪中添加的凝乳酶能够促进成熟期内蛋白的降解,且乳清可以被奶酪中的微生物利用,使其在成熟期内的12% TCA-SN含量增加,成熟后期12% TCA-SN含量的上升趋势放缓,原因可能是发酵后期奶酪内微生物的活力及数量均低于成熟前期[29],且奶酪在成熟期内蛋白降解致使发酵后期大分子的蛋白含量较发酵前期减少,则使得成熟后期12% TCA-SN的上升趋势放缓[30-32]。

图7 不同奶酪成熟期内12% TCA-SN含量的变化

2.4.3 不同奶酪成熟期内蛋白降解SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE电泳考察奶酪成熟期内蛋白质的降解情况。SDS-PAGE依靠不同蛋白片段和肽片段分子量的不同将其以条带形式分布排列出来,条带颜色的深浅反映该种蛋白或肽片段含量的多少。不同工艺奶酪在不同成熟时间的SDS-PAGE电泳见图8。图8中包含3条主要条带,代表了3种不同类型的酪蛋白,Zone 1主要包含β-酪蛋白,Zone 2主要为αs-酪蛋白,Zone 3主要包含k-酪蛋白。

图8 不同奶酪成熟期内蛋白降解的变化Fig.8 The changes in protein degradation of different cheese during maturation

由图8可知,在成熟0 d时,对照奶酪与乳清奶酪中Zone 1、Zone 2条带颜色深,代表该成熟期内β-酪蛋白与αs-酪蛋白含量高,这是由于成熟初期,奶酪中凝乳酶、微生物产生的酶对蛋白降解有限,且该成熟期内乳清奶酪较对照奶酪条带颜色更深,由此可说明乳清奶酪中两种蛋白的含量高于对照奶酪。当成熟期为30 d时,两种奶酪Zone 1、Zone 2、Zone 3条带颜色与0 d时相比变浅,这说明此时期奶酪随着内部微生物数量的增加,蛋白开始由奶酪中微生物与其他酶类物质协同作用被逐步降解,导致条带颜色变浅[33-35]。成熟期60 d时,条带颜色持续变浅,表明此阶段的奶酪内部蛋白降解作用增强,大分子蛋白被分解为小分子蛋白或肽片段,致使此阶段各区域条带颜色变浅。凝乳时间达到90 d时,对照奶酪各区域条带颜色进一步变浅,说明在成熟末期奶酪中蛋白逐渐降解为小分子肽类等物质,乳清奶酪在该阶段条带颜色仍较深,其原因可能是相较于对照奶酪,乳清奶酪中乳清蛋白含量更高,能够形成乳清蛋白中的酪蛋白纤维聚合物,使其交联程度较对照奶酪更加紧密,导致其条带颜色更深。

续 表

2.5 不同奶酪成熟期内游离氨基酸含量的变化

由表1可知,总计分离出15种氨基酸,且不同种类氨基酸含量存在差异。在奶酪成熟初期,两种工艺制作的奶酪氨基酸含量均呈现出上升的趋势。成熟初期,奶酪中氨基酸含量的升高是由于奶酪中蛋白质的递进式分解。成熟0 d时,苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸的含量较高,其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸主要呈现苦味,谷氨酸呈现微酸味,而苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸则呈现甜、鲜、苦味,在成熟0 d时,上述氨基酸的含量高,使得奶酪在此成熟时期呈现甜、鲜、苦、酸多种风味。且在该成熟时期,对照奶酪和乳清奶酪中均未检出赖氨酸。赋予苦味的氨基酸由酪蛋白产生,是由于酪蛋白在奶酪中微生物产生的酶的降解以及制作奶酪时添加的凝乳酶与酪蛋白的水解协同作用所致。成熟30 d时,两种奶酪均检出赖氨酸,且其余的氨基酸较成熟0 d时均呈现出大幅度的上升,其中谷氨酸、亮氨酸的含量较高。当奶酪成熟至60 d时,除了苏氨酸、苯丙氨酸外,其余氨基酸含量均呈现出不同幅度的下降。总体来看,两种奶酪中氨基酸总含量随着凝乳时间的增加呈现小幅度下降的趋势。通过观察不同种类的氨基酸在成熟过程中的变化趋势可以发现,随着成熟时间的增加,并不是所有种类氨基酸的含量都随着奶酪成熟期的延长而增加。除苏氨酸、苯丙氨酸的含量随着成熟时间的增加而增加外,其他氨基酸在成熟期30~90 d内,其氨基酸含量均呈现出先下降后上升的趋势,其原因可能是奶酪中的微生物活动所产生的酶将奶酪中的氨基酸转化成了其他类型的物质,然后随着凝乳时间的增加,微生物的活性降低,蛋白质的降解程度不断增加,致使发酵后期奶酪中氨基酸的含量再次呈现上升的趋势。

表1 不同奶酪成熟期内游离氨基酸含量的变化

3 结论

为充分利用乳清中的营养成分和残留的凝乳酶,降低奶酪制作过程中凝乳酶的使用量,节约制作成本,本实验通过对比添加乳清的马苏里拉奶酪和不添加乳清的马苏里拉奶酪在成熟期(0,30,60,90 d)内理化性质、蛋白质含量和氨基酸含量等指标的变化和差异进行分析,探究添加乳清对马苏里拉奶酪成熟过程中蛋白降解的影响。试验得出如下结论:

在成熟期内两种奶酪的pH、蛋白含量、水分含量随着成熟时间的增加呈下降的趋势,奶酪的L值下降,b值先下降而后小幅度上升,pH 4.6 SN和12% TCA-SN随着成熟时间的增加呈现上升的趋势,奶酪中总氨基酸的含量呈先上升再小幅下降而后又上升的波动式变化。与对照奶酪相比,乳清奶酪在成熟期内pH值更低,蛋白质含量、pH 4.6 SN和12% TCA-SN含量更高,水分活度较高,色泽指标L*值、b*值较高,总氨基酸含量及每种氨基酸含量均高于对照组的马苏里拉奶酪。

猜你喜欢

马苏乳清酪蛋白
乳制品中A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白含量的测定
蛋氨酸对奶牛乳腺酪蛋白合成及其上皮细胞自噬的影响
乳清蛋白的功能特性分析及在乳制品中的应用研究
乳清蛋白的特性及其在乳制品生产中的应用
β-酪蛋白的功能特性及其在婴儿配方乳粉中的应用研究进展
童心童画
国际运动营养品
孔令辉&马苏:感谢过往
孔令辉&马苏:感谢过往
乳清蛋白的营养作用及其在乳制品中的应用