鲐鱼多肽的提取工艺优化及抗疲劳研究现状

任 昊

(新乡医学院，河南 新乡 453003)

1 概述

鲐鱼属于鲈形科鲐属，体型较大，产量高，分布于我国各个流域，在黄海与东海分布最为广泛，是太平洋地区最重要的经济鱼类之一[1]。鲐鱼含有丰富的蛋白质和脂肪、多种矿物质元素钙、磷和铁、活性物质核黄素、DHA和EPA。鲐鱼中含有的各类活性物质在人体的神经、免疫和骨骼发育方面有重要作用[2-3]。鲐鱼价格低廉，为了保护鲐鱼相关的水产品产业，研究鲐鱼产品深加工技术成为目前急需解决的问题[4]。

多肽由20种氨基酸通过不同的排列方式组成，从二肽到多肽结构，它的分子结构是介于氨基酸和蛋白质之间的一种化合物，每一种多肽都有其独特的结构，不同的结构形式代表其功能的不同[5-6]。常见的功能性多肽包括抗肿瘤多肽、抗疲劳多肽、抗氧化多肽、抗炎性多肽和抗菌多肽。迄今为止，已经发现的功能性多肽超过1000种，多肽的使用和开发将会在我们的生活中占有不可忽视的地位[7-8]。

本研究侧重于对鲐鱼多肽的提取工艺进行研究，从蛋白酶的选择、蛋白酶的用量、pH值和最适温度4个方面对鲐鱼多肽的提取进行优化；同时将提取的鲐鱼多肽与西洋参提取液进行抗疲劳活性对比，研究鲐鱼多肽抗疲劳活性的强弱。通过对鲐鱼多肽提取工艺参数进行优化，获得最佳参数条件，为鲐鱼多肽的提取工艺提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

鲐鱼、胰蛋白酶、硫酸铜、酸性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、磷酸二氢钠、牛血清、二苯基苦基、氢氧化钠、盐酸、双氧水、中性蛋白酶、番红花T、硫酸亚铁、三氯乙酸、磷酸氢二钠[9-10]。

2.2 仪器设备

天平、烘箱、分光光度计、水浴锅、高速离心机、pH计、干燥机、真空泵[11]。

2.3 鲐鱼多肽提取工艺优化操作方法

2.3.1 最佳用酶的筛选方法

取少量的鲐鱼肉，用粉肉机器将其粉碎，之后按照鲐鱼肉的重量，加入6倍相同体重的蒸馏水，在25 ℃水浴锅中不断地搅拌，使蛋白酶达到最佳的酶解温度，维持温度10 min，再用氢氧化钠或者盐酸调节至最适合的pH[12-13]。将胰蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶分别加入1000 U在5个烧杯中，同时加入1 g鱼肉，充分地拌匀。在酶解的过程中，每间隔1 h取一次酶解液，然后将酶解液加热至100 ℃左右使蛋白酶失去活性。用酸或者碱调节酶解液的pH至中性，在4 ℃的环境下离心10 min, 将上清液放置于-4 ℃的低温环境中保存备用[14]。

随着蛋白质水解程度的增强，溶液中的氨基酸含量不断增加。因此，水解液中的氨基酸含量在一定程度上也反映了蛋白质的水解程度，本研究采用甲醛滴定法测定蛋白质的水解度。鲐鱼多肽具有清除DPPH自由基的能力，通过测量DPPH自由基的清除率也能间接地测量鲐鱼多肽的含量[15-16]。本方法中DPPH自由基的清除率参考文献略做修改[17]，将5种水解酶获得的水解产物分别装入5支试管中，同时各加入1 mL浓度为50%的乙醇，最后加入浓度为0.1 mol/mL的DPPH自由基少许，摇匀，室温放置0.5 h，在517 nm的紫外光下进行比色。用50%的乙醇作为空白组；用50%的乙醇代替样品作为对照组。DPPH自由基清除率利用下式进行测定[18]。

DPPH自由基清除率(%)=1-(A样品-A空白)/(A对照-A空白)。

式中：A样品为5种不同水解酶的水解液；A空白为50%的乙醇替代水解液；A对照为50%的乙醇替代样品。

2.3.2 鲐鱼多肽制备的加酶量、酶解时间、温度和pH值影响实验方法

影响酶解反应的因素包括加酶量、酶解时间、温度和pH值，每个因素的改变都会影响酶解产物的组成和酶的生物活性，所以，通过对单因素的分析，同时以DPPH自由基清除率作为指标，筛选出适合鲐鱼多肽制备的最优条件[19]。

2.4 鲐鱼多肽抗疲劳活性研究操作方法

3组小鼠分别是饲喂无菌水作为空白组，饲喂西洋参作为对照组，饲喂鲐鱼多肽作为实验组。饲喂完小鼠30 min后，在小鼠的尾部负重10%的体重铅条，将小鼠放置于25 ℃左右的恒温箱中，恒温箱水深为50 cm，直至小鼠沉入水中30 s不再上浮，视为力竭死亡，记录时间为将小鼠放置于恒温箱至小鼠死亡时间，作为小鼠力竭游泳时间[20-21]。

3 鲐鱼多肽的提取工艺优化

3.1 5种水解蛋白酶的筛选

由图1可知，水解度最高的为中性蛋白酶，水解度为20.2%，其次依次为风味蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶，水解度分别为18.1%、10.0%、8.0%和5.0%；DPPH自由基清除率中性蛋白酶达到50%，在本实验中达到了最高，其次是风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和酸性蛋白酶，DPPH自由基清除率分别为45%、32%、30%和25%。中性蛋白酶在水解度和DPPH自由基清除率方面均为最高，所以，以中性蛋白酶作为最佳用酶进行鲐鱼多肽的制备和抗疲劳活性研究。

图1 5种蛋白酶水解鲐鱼多肽的水解度及活性测定Fig.1 The hydrolysis degree and activity determination of peptides from Scomber japonicus hydrolyzed by five kinds of proteases

3.2 加酶量对DPPH自由基清除率的影响

在鲐鱼肉中加入其重量10倍的纯净水，选用上述实验中的最优水解蛋白酶中性蛋白酶作为水解酶，调节中性蛋白酶的浓度分别为800，1000，1200，1400，1600，1800 U/g。

由图2可知，当中性蛋白酶浓度低于1600 U/g时，DPPH自由基清除率随着中性蛋白酶浓度的增加而增加；当中性蛋白酶浓度高于1600 U/g时，随着加酶量的增加，DPPH自由基清除率明显下降。所以1600 U/g为最佳的加酶量，此研究结果也与之前研究者的研究结果相同[22-23]。

图2 加酶量对DPPH自由基清除率的影响Fig.2 The effect of the additive amount of enzyme on the scavenging rate of DPPH free radicals

3.3 pH对DPPH自由基清除率的影响

在鲐鱼肉中加入其重量10倍的纯净水，选用上述实验中的最优水解蛋白酶中性蛋白酶作为水解酶，使用盐酸或者氢氧化钠调节水解液的pH值分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。

由图3可知，当水解液中的pH值低于7.0时，DPPH自由基清除率呈现上升的趋势，当pH值大于7.0时，DPPH自由基清除率呈现下降的趋势。当水解液中pH值为7.0时，中性蛋白酶对DPPH自由基的清除率为70%，是整个实验中最大的清除率，其次是pH为6.0，8.0，5.0，9.0，对DPPH自由基的清除率分别为60%、60%、50%、50%，所以选择pH 7.0作为鲐鱼多肽提取的最佳pH值。

图3 pH对DPPH自由基清除率的影响Fig.3 The effect of pH value on the scavenging rate of DPPH free radicals

3.4 温度对DPPH自由基清除率的影响

在鲐鱼肉中加入其重量10倍的纯净水，选用上述实验中的最优水解蛋白酶中性蛋白酶作为水解酶，设置酶解温度为30，40，50，60，70 ℃。

由图4可知，不同的温度，中性蛋白酶对DPPH自由基的清除率不同，当中性蛋白酶的酶解温度为40 ℃时，中性蛋白酶对DPPH自由基的清除率最高，清除率为70%；当温度大于40 ℃时，DPPH自由基清除率随着温度的升高而降低；当温度小于40 ℃时，DPPH自由基清除率随着温度的升高而升高，该实验中最优的鲐鱼多肽提取温度为40 ℃。

图4 温度对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 The effect of temperature on the scavenging rate of DPPH free radicals

4 鲐鱼多肽抗疲劳活性研究

机体的疲劳体现在运动耐力的下降，在运动的过程中，肌肉对耗氧量、血糖和蛋白质的消耗增加，导致疲劳现象的产生，运动能力的强弱能够直接反映机体的疲劳程度。本实验选用小鼠游泳实验对鲐鱼多肽的抗疲劳活性进行研究。

由图5 可知，3种物质在相同浓度的条件下，鲐鱼多肽的抗疲劳活性最强，小鼠力竭游泳时间为70 min，其次为西洋参的抗疲劳活性，小鼠力竭游泳时间为45 min。

图5 3种不同的抗疲劳活性物质对小鼠力竭时间的影响Fig.5 The effect of three different anti-fatigue active substances on exhaustion time of mice

5 结论

通过本研究可以得出：鲐鱼多肽提取的最佳技术参数为鲐鱼的水解蛋白酶为中性蛋白酶，添加的酶浓度为1600 U/g，pH值为7.0，温度为40 ℃。鲐鱼多肽的抗疲劳活性高于西洋参提取物的抗疲劳活性。

随着经济的快速发展，人们的生活节奏快，长时间处于较高压力和超负荷的工作量环境下，人们极易产生疲劳，机体的疲劳又易导致各类疾病的产生。我们无法改变生活压力，但是可以通过借助各种各样具有抗疲劳功效的保健品和药物来缓解机体疲劳。我国的抗疲劳产品来源广泛，很多研究人员从食用菌中获得抗疲劳活性的物质：金耳[24]、灵芝、羊肚菌；天然植物：山药、人参；水果：蓝莓、苹果以及鱼类或一些海洋生物身体内具有一些抗疲劳功效的活性肽。鲐鱼多肽作为以后抗疲劳活性物质进行开发和利用具有广阔的市场前景。