低共熔溶剂协同超声波提取红枣中总黄酮的研究

王小佳，于有伟，崔美林，郑朋凯，张少颖

(山西师范大学 食品科学学院，山西 临汾 041004)

红枣是鼠李科枣属植物枣树的果实，富含氨基酸、糖类、矿物质、维生素、黄酮类等成分。红枣属于药食同源的食品原料，医疗保健价值极高，具有保护肝脏和养胃健脾等功效[1]。红枣产业是山西省的特色农业产业之一，在乡村振兴中具有重要作用。近几年红枣生产供大于求，价格低迷，造成滞销[2]。黄酮类化合物 (flavonoids)是泛指具有C6-C3-C6结构的一系列化合物，是由两个苯环通过三碳相互连接而成的(见图1)[3]，红枣中含有丰富的黄酮类化合物。许多研究表明，黄酮类化合物有多种生物活性，能消除人体内积累的自由基，从而防止细胞的衰老，防止癌症的发生。黄酮还可以降低胆固醇，降低血压，除去血垢，软化血管，防止心血管病的发生。除此之外，黄酮能杀灭细菌，清热解毒，抗炎，消肿，促进伤口愈合和止痛，改善肾功能等[4]。

图1 黄酮类化合物的结构示意图

低共熔溶剂是由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐)和氢键供体(如酰胺、羧酸和多元醇等化合物)组成的低共熔混合物，是一种绿色溶剂，它的凝固点远低于其组成成分纯物质的熔点，又被人们称为离子液体类似物。但它比离子液体更易制备，价格较低，毒性小，不容易挥发，溶解性比较好，因此在混合物分离的领域应用非常广泛[5]。超声波能加速浸提的成分从原料向溶剂扩散，被广泛应用到功能成分的提取方面[6]。本试验以红枣为原料，用低共熔溶剂协同超声波提取红枣中的总黄酮化合物，对红枣原料进行深度开发。本研究在一定程度上可以缓解红枣卖果难的问题，对于枣业的发展具有重要的参考意义；同时，所提取的黄酮是一种源于水果的营养功效非常高的天然成分，在食品行业具有非常高的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

红枣：稷山板枣，购于临汾市尧丰农贸市场；芦丁标准品：优级纯，购自中国药品生物制品检定所；柠檬酸、亚硝酸钠、乙醇：均为分析纯，购于天津市光复科技发展有限公司；氢氧化钠、硝酸铝、氯化胆碱：均为分析纯，购于山东西亚化学工业有限公司。

1.2 仪器与设备

752N紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；H1850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；GZX-9246数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ISO-9001电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；WBL25B26搅拌料理粉碎机 广东美的电器股份有限公司。

1.3 低共熔溶剂的制备

将组成摩尔比为1∶2的氯化胆碱/柠檬酸、氯化胆碱/蔗糖、氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/丙三醇、氯化胆碱/乳酸分别置于烧杯中，采用磁力搅拌器在100 ℃下搅拌加热，直至形成澄清、均一的溶液，随后冷却至室温备用[7]。

1.4 红枣样品中总黄酮的提取

选取稷山板枣，人工去核，然后将去核后的枣放入干燥箱中60 ℃下烘干[8]。随后放入搅拌机中粉碎，过60目筛，得到红枣粉末。准确称取红枣粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中，加入一定量的不同稀释比例的低共熔溶剂。采用不同功率的超声波在60 ℃下提取一定时间，然后将提取液采用5000 r/min离心15 min，取上清液，测定总黄酮含量。

1.5 试验设计

试验首先筛选低共熔溶剂体系，然后确定遴选的低共熔溶剂体系组成比例。随后考察低共熔溶剂稀释倍数等几个提取因素对黄酮得率的影响，并进行正交试验优化，得出最佳提取条件。

1.6 总黄酮的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法，以芦丁为标准对照品，参照李利华的方法进行测定[9]。准确称取芸香叶苷20 mg于烧杯中，并加60%乙醇溶液溶解，然后用玻璃棒移至100 mL容量瓶中。用60%乙醇溶液分次洗涤烧杯并移入容量瓶后，定容，即得芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，移入10 mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀后放5 min。再加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀放6 min。最后加入4%的氢氧化钠溶液4 mL，定容至10 mL，摇匀放15 min。用60%乙醇溶液作为参比溶液，在波长510 nm处测定其吸光度值。取提取液离心后的上清液，经过相同的显色过程，测吸光值。代入回归方程，按照下列公式计算总黄酮的含量。

式中：X为样品液所测吸光值对应的标准曲线上的浓度(mg/50 mL)；V为样品液体积，mL；N为稀释倍数；m为提取样品的质量，g。

1.7 统计分析

试验各处理重复3次，采用DPS 7.05进行数据统计分析，多重比较采用Duncan's新复极差法。

2 结果与分析

2.1 总黄酮标准曲线的绘制

由图2可知，芦丁标准曲线的回归方程为y=9.6248x-0.0254(R2=0.9999)，且在0～2 mg/50 mL内存在良好的线性关系。

图2 芦丁的标准曲线

2.2 低共熔溶剂体系种类的筛选

称取红枣粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中，分别加入稀释30倍，组成摩尔比为1∶2的氯化胆碱/柠檬酸、氯化胆碱/蔗糖、氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/丙三醇、氯化胆碱/乳酸各20 mL，在60 ℃超声100 W条件下提取30 min。由图3可知，在氯化胆碱/柠檬酸、氯化胆碱/蔗糖、氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/丙三醇、氯化胆碱/乳酸5种低共熔溶剂体系中，氯化胆碱/乙二醇对红枣总黄酮的提取率最高(P<0.05)。氯化胆碱/丙三醇的提取率也比较高，提取率最低的是氯化胆碱/柠檬酸体系。因此在接下来的试验中，选取氯化胆碱和乙二醇所制备的低共熔溶剂提取红枣中的总黄酮。

图3 不同低共熔溶剂体系对红枣总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of different deep eutectic solvent systems on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

2.3 低共熔溶剂稀释倍数

称取红枣粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中，分别加入稀释倍数为1，10，20，30，40倍且组成摩尔比为1∶2的氯化胆碱/乙二醇20 mL，在60 ℃超声100 W条件下提取30 min。由图4可知，氯化胆碱/乙二醇低共熔溶剂体系从1倍稀释到10倍时，提取率从0.50 mg/g达到3.20 mg/g，提高了5.4倍。低共熔溶剂稀释倍数从10倍增加到40倍时，随着稀释倍数的进一步增大，提取率逐渐降低。稀释到40倍时，提取率为1.30 mg/g，仅为稀释10倍时提取率的40%。原因可能是低共熔溶剂有一定的极性和黏度，稀释倍数增大，适当降低黏度，有助于增大黄酮成分的迁移速度。但是，稀释倍数过大，极性增大，黄酮化合物的极性差别太大，反而不易于黄酮成分的迁移[10]。综上所述，在随后试验中，选择稀释10倍的氯化胆碱/乙二醇低共熔溶剂体系。

图4 氯化胆碱/乙二醇体系稀释倍数对红枣总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of dilution ratio of choline chloride/ethylene glycol system on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

2.4 料液比

称取红枣粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中，分别加入稀释10倍及组成摩尔比为1∶2的氯化胆碱/乙二醇10，15，20，25，30 mL，在60 ℃超声100 W条件下提取30 min。由图5可知，随着料液比的增大，红枣总黄酮的提取率逐渐增大。当料液比为1∶20时，提取率为3.21 mg/g，是料液比1∶10时提取率的4.1倍；随着料液比进一步增大到1∶25，提取率几乎没有变化(P>0.05)。原因可能为增加溶剂提高了红枣粉与溶剂之间的浓度差，同时红枣粉颗粒的扩散空间增加，使红枣粉与溶剂之间的有效接触面积增大，有助于更多的黄酮成分扩散到溶剂中[11]。当料液比达到1∶20时，扩散达到平衡，随着料液比的增大，提取率几乎没有增加。

图5 料液比对红枣总黄酮提取率的影响

2.5 超声功率

称取红枣粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中，加入稀释30倍及组成摩尔比为1∶2的氯化胆碱/乙二醇20 mL， 60 ℃条件下分别在0，80，100，120，140 W超声提取30 min。由图6可知，当超声功率从0 W增加到100 W时，红枣总黄酮的得率随着超声功率的增加逐渐增大。在100 W时，达到3.21 mg/g，是未超声处理的3.6倍。当超声功率从100 W增加到140 W时，提取率降低48.3%(P<0.05)。原因可能是随着超声功率的增加，超声破坏细胞壁的程度增加，有助于黄酮成分从细胞中迁移到溶剂中。但是，黄酮是具有C6-C3-C6结构的复杂大分子化合物，高强度的超声处理可能会破坏黄酮的结构，黄酮的提取率反而会降低[12-13]。综上所述，本试验选择100 W作为黄酮的提取条件。

图6 超声功率对红枣总黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

2.6 提取时间

称取红枣粉1 g置于50 mL具塞三角瓶中，分别加入稀释30倍及组成摩尔比为1∶2的氯化胆碱/乙二醇10，15，20，25，30 mL，在60 ℃、超声100 W条件下提取20，30，40，50，60 min。由图7可知，总黄酮的提取率随提取时间的延长逐渐增加。在30 min时，提取率基本接近平衡，达到3.21 mg/g。随着提取时间的进一步增加，由于大多数黄酮已经溶出，总黄酮的得率没有显著变化(P>0.05)。

图7 超声提取时间对红枣总黄酮提取率的影响Fig.7 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of total flavonoids from red jujube

2.7 正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验对低共熔溶剂协同超声波提取红枣中总黄酮的条件进行了优化，结果见表1。

表1 正交试验结果

由表1中极差R值可知，本试验中影响红枣总黄酮提取率各因素的主次顺序是低共熔溶剂稀释倍数>超声波功率>料液比>提取时间，表明低共熔溶剂在协同超声波提取红枣总黄酮时具有比较强的作用。直观试验表明，处理组A2B3C1D2的红枣黄酮的提取率最高，为3.27 mg/g；而由k值可知A2B3C2D2为最优组合。经过验证试验，低共熔溶剂协同超声波提取红枣中总黄酮时，在最优组合低共熔溶剂稀释倍数为10倍、料液比为1∶22、超声波功率为100 W、提取时间为30 min的条件下，红枣中总黄酮的提取率为3.32 mg/g。

3 结论

低共熔溶剂协同超声波提取红枣中总黄酮时，采用摩尔比为1∶2的氯化胆碱/乙二醇作为低共熔溶剂体系。在红枣粉过60目筛、60 ℃的提取条件下，随着低共熔溶剂稀释倍数和超声波功率的增大，红枣总黄酮的提取率先升高后降低；随着料液比的增大和提取时间的延长，红枣总黄酮的提取率逐渐增大并达到平衡。低共熔溶剂协同超声波提取红枣中总黄酮的最佳工艺条件为低共熔溶剂稀释10倍、料液比1∶22、超声波功率100 W、提取30 min，在此优化的条件下，红枣中总黄酮的提取率为3.32 mg/g。红枣总黄酮具有丰富的特殊营养功效，有望未来在食品中得到广泛的应用。