顶空毛细管GC法测定马波沙星原料药中6种溶剂的残留量

董玲玲，汪 霞，杨 星，马秋冉，于晓辉，赵富华

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

马波沙星(Mabofloxacin) 又名麻保沙星，化学名为9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-2,3-二氢-7H-吡啶-[3,2,1-ij][4,1,2]-苯并噁二嗪-6-羧酸，通过抑制细菌复制中所需的 DNA 拓扑异构酶II和IV而表现杀菌作用[1]，是一种动物专用的第三代喹诺酮类抗菌药物，抗菌谱广，对绝大多数革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性[1-2]，且具有很高的生物利用度[3]，统计国内现有企业马波沙星原料的合成工艺，使用了包括甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯与甲苯在内的6种溶剂[4-6]，因此，根据《中国兽药典》2015年版[7]及VICH[8]的相关规定，采用顶空毛细管气相色谱法同时测定上述6种溶剂的残留量。

1 仪器与试药

Agilent 7890A气相色谱仪，配Agilent 7697A顶空进样器及FID检测器，ChemStation色谱工作站;METTLER TOLEDO XS 205电子天平。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯与甲苯均为分析纯。N,N-二甲基甲酰胺为色谱纯。马波沙星原料来自两个企业，企业1批号:171101、171201、171202；企业2批号：160919、161011、170306。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:DB-624毛细管柱(30 m×0.53 mm, 3.0 μm)； 载气:高纯氮; 初始温度为40 ℃，维持10 min后，以每分钟20 ℃的速率升温至80 ℃，维持2 min，再以每分钟30 ℃的速率升温至200 ℃，维持5 min。以氮气为载气，线速为每秒24.1 cm，分流比为5∶1；进样口温度为180 ℃；检测器为火焰离子化检测器(FID)，检测器温度为250 ℃；顶空瓶平衡温度为105 ℃，平衡时间为20 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液制备 取本品约0.1 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加N,N-二甲基甲酰胺1 mL，密封，作为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液配制方法 分别精密称取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯与甲苯适量，加二甲基甲酰胺定量稀释制成每1 mL中分别含甲醇0.3 mg、乙醇0.5 mg、乙腈0.041 mg、二氯甲烷0.06 mg、苯0.002 mg和甲苯0.089 mg 的混合溶液，精密量取1 mL，置顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。

2.3 专属性 溶剂空白：精密量取1 mL N,N-二甲基甲酰胺置顶空瓶中，密封，即得。取溶剂空白及2.2项下的对照品溶液和供试品溶液按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图(图1～图4)。结果表明，空白溶剂无干扰峰出现; 对照品溶液色谱图中，各残留溶剂分离度良好；两个企业供试品色谱图中，残留溶剂出峰处无干扰。

图1 溶剂空白色谱图(DMF)Fig 1 Chromatogram of solvent(DMF)

图2 残留溶剂对照品溶液色谱图出峰顺序依次为甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯、甲苯、DMFFig 2 Chromatogram of six kinds of residual solventsThe peak outflows by methanol, ethanol, acetonitrile, dichromethane, benzene and toluene

图3 供试品溶液残留溶剂色谱图(企业1)Fig 3 Chromatogram of Marbofloxacin draw material (sample1)

图4 供试品溶液残留溶剂色谱图(企业2)Fig 4 Chromatogram of Marbofloxacin draw material (sample2)

2.4 检测限和定量限 取对照品溶液加N,N-二甲基甲酰胺系列稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比约为3时的浓度，作为检测限；以信噪比约为10时的浓度，作为定量限，结果见表1。

2.5线性和范围 分别精密称取6种残留溶剂适量，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀释使成每1 mL中含甲醇30.0 mg、乙醇50.0 mg、乙腈4.1 mg、二氯甲烷6.0 mg、苯0.02 mg 和甲苯8.9 mg 的对照贮备液，用N,N-二甲基甲酰胺逐步稀释使成梯度浓度。分别精密量取上述稀释溶液各1 mL，置顶空瓶中，密封，进样。以浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，分别进行线性回归，结果6种溶剂的浓度与峰面积均呈良好的线性关系(表1)。

表1 马波沙星残留溶剂的标准曲线、检测限和定量限结果表Tab 1 Results of range, linearity, limit of detection and limit of quantification.

2.6 精密度 取2.5项下的对照贮备液0.1 mL至10 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，平行制备6份，按2.1项下色谱条件进样测定，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯、甲苯6次进样峰面积的RSD结果分别为2.1%，3.0%，3.8%，2.8%，3.3%和4.9%，精密度良好。

2.7 重复性 取马波沙星原料(企业1，批号171202) 制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件分别进样，检出甲醇含量的均值为0. 01%，RSD为0%，其余均未检出。

2.8 准确度 混合对照品溶液：取2.5项下的对照贮备液1 mL至10 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。

分别取9份马波沙星原料(企业1，批号171202)各0.1 g，依次精密加入上述各混合对照品溶液0.08、0.1、0.12 mL，配制成相当于80%、100%和120%限度的混合对照品溶液各3份。按2.1项下色谱条件进样测定，结果为：甲醇的平均回收率为113.3%(RSD=6.8%)；乙醇的平均回收率为116.4%(RSD=3.7%)、乙腈的平均回收率为109.7%(RSD=4.0%)、二氯甲烷的平均回收率为115.6%(RSD=5.9%)、苯的平均回收率为103.3%(RSD=6.7%)、甲苯的平均回收率为115.3%(RSD=6.2%)。

2.9 稳定性 取2.2.2项下对照品溶液4份，分别于0、6、12和24 h按2.1项下方法测定，记录6种残留溶剂的峰面积，考察溶液的稳定性。甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯和甲苯峰面积的RSD分别为0.9%、1.0%、1.5%、1.6%、2.0%和0.9%，各待测成分色谱峰面积的RSD≤2.0%。说明该溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 供试品测试结果 取2个企业6批供试品，按2.1项下色谱条件分别进样测定，按外标法以峰面积计算，结果见表2。

表2 马波沙星残留溶剂结果表Tab 1 Results of residual solvents in Marbofloxacin draw material.

测定过程中使用的色谱柱为DB-624/30 m,0.53 mm,3.0 μm。

3 讨 论

3.1 溶剂的选择 研究之初拟采用较环保且经济的0.5 mol/L氢氧化钠溶液作为溶剂[9]，但其在乙腈和二氯甲烷出峰处有干扰，因此，又考察N’N-二甲基甲酰胺(DMF)、N’N-二甲基乙酰胺(DMA)和二甲基亚砜(DMSO)，考虑到DMF毒性相对较小，最终采用DMF作为溶剂。

3.2 顶空平衡时间和平衡温度的选择 因本法采用DMF为溶媒，沸点较高，为保证马波沙星原料中的残留溶剂能更好的释放达到平衡，拟采用较高的平衡温度，考察100、105、110、115 ℃，平衡15、20、25、30 min的残留溶剂结果，结果表明：固定平衡温度为105 ℃时，20 min之后随平衡时间延长，供试品中残留溶剂量无明显增加，确定平衡时间为20 min；固定平衡时间为20 min，两个企业供试品中乙醇和甲苯的检出量随平衡温度增加而增加，在105 ℃之后趋于平衡，但企业1供试品随平衡温度增加而颜色加深明显，为防止因供试品降解而产生乙醇，最终确定平衡温度为105 ℃。

3.3 结果判定 根据VICH和《中国兽药典》2015年版附录规定，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯和甲苯的残留限度分别为：不得超过0. 3%、0. 5%、0.041%、0.06%、0.0002%和0.089%[7-8]。实际测定过程中若残留溶剂峰面积低于检测限，判为未检出；残留量低于限度判为符合规定。本试验结果表明，2个生产企业的6批供试品检测结果均符合规定。

综上所述，本方法简单、灵敏、准确、可操作性强，可以用于马波沙星原料药中6种残留溶剂的检测。