高效液相色谱法测定复合酚中醋酸含量

王 璇，汪 澄，熊 玥

(江苏省兽药饲料质量检验所, 南京 210036)

复合酚是由酚(41.0%～49.0%(g/g))、醋酸(22.0%～26.0%(g/g))及十二烷基苯磺酸等配制而成的深红褐色水溶性混合物，是一种有醋酸和煤焦油特臭的消毒防腐药[1]。方中酚类作为 “原浆毒”，可使菌体蛋白变性、沉淀[2]；醋酸作为助溶剂，本身对细菌、真菌、芽孢和病毒均有较强的杀灭作用[3]；十二烷基苯磺酸通过改变菌体细胞膜的通透性，使菌体溶解和破裂[2]。加水稀释后的复合酚常用于动物厩舍、笼具、饲养场地、排泄物的消毒[4]。其产品质量标准收载于《兽药质量标准》2017年版化学药品卷[1]，现标准中采用滴定法测定醋酸含量，但先需使用甲苯法(《中国兽药典》2020年版一部 附录0832 第二法[5])测定水分的装置对供试品中的醋酸进行提取分离，操作较为繁琐，测定结果偏差较大。为解决这一问题，本研究拟开发高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-PDA)测定复合酚中醋酸含量的方法，以期为复合酚质量标准修订提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器 ACQUITY Arc高效液相色谱仪配2998二极管阵列检测器及Empower 3色谱工作站软件(美国Waters公司)；XS205DU分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 药品与试剂 冰乙酸对照品购自中国食品药品检定研究院(批号190079-202103；以C2H4O2计，含量为99.9%(HPLC))。乙腈为色谱纯(美国MERCK公司)；磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；所用水为超纯水(自制)。复合酚供试品(批号：21031001、21031002、21031003)、缺醋酸的阴性对照供试品均由本省某企业提供。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK MG Ⅱ C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相A为0.05%磷酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱：0～5.0 min，95% A～95% A；5.0～5.5 min，95% A～10% A；5.5～9.5 min，保持10% A；9.5～10.0 min，10% A～95% A；10.0～20.0 min，保持95% A。二极管阵列检测器，采集波长范围为190～400 nm，分辨率1.2 nm，记录210 nm波长处的色谱图。

1.3.2 标准工作液的制备 取加有水10 mL的50 mL量瓶，精密称定，加入冰乙酸对照品0.55 mL，具塞，再精密称定，用水稀释至刻度，摇匀，制成浓度为11.23 mg/mL的醋酸对照品贮备溶液；临用前用水稀释制成浓度为0.112、0.674、0.842、1.123、1.403、1.684、2.246 mg/mL的标准工作液。

1.3.3 供试品溶液的制备 取复合酚供试品约0.5 g，精密称定，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3.4 阴性对照溶液的制备 取阴性对照供试品约0.5 g，同1.3.3项下方法制备，得阴性对照溶液。

2 结果与分析

2.1 系统适用性和专属性试验结果 分别量取供试品溶液、浓度为1.123 mg/mL的标准工作液、阴性对照溶液按1.3.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图与光谱图。在该色谱条件下，标准工作液中醋酸色谱峰的保留时间为4.20 min；供试品溶液中出现与标准工作液中醋酸色谱峰保留时间及光谱图一致的色谱峰，该峰纯度角度小于纯度阈值，可认为是单一物质峰，且分离度符合要求；阴性对照溶液在此时间附近无吸收峰；以醋酸峰计算，理论塔板数大于20000。结果表明，系统适用性可以满足检测要求，处方中其他成分对醋酸的检测无干扰。结果见图1。

图1 供试品溶液 (A)，标准工作液 (B)，阴性对照溶液 (C)的高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of test solution (A),standard working solution (B), negative control solution (C)

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 取浓度为1.123 mg/mL的标准工作液，连续进样6次，每次进样10 μL，测定峰面积，计算峰面积的RSD为0.07%，表明方法精密度良好。

2.2.2 线性关系考察 按 1.3.2项下方法制备系列浓度标准工作液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以标准工作液浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线和相关系数，回归方程为：Y= 350947X+6658.5，r=0.9995。结果表明，在0.112 ～2.246 mg/mL范围内，醋酸具有良好的线性关系。

2.2.3 重复性试验 取复合酚供试品(批号：21031001)，按1.3.3项下方法平行配制6份，照1.3.1项下色谱条件分别测定，记录峰面积，计算含量。测得每克供试品中醋酸平均含量为223.9 mg，RSD为0.39%，表明方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按上述色谱条件，分别在0、4、8、12、24、48 h进样10 μL，记录醋酸峰面积，其RSD为0.15%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.2.5 加标回收率试验 取已知含量的复合酚供试品(批号：21031001)约0.25 g，精密称定，置100 mL量瓶中，按供试品已知含量的80%、100%、120%三个水平分别精密添加浓度为11.23 mg/mL的醋酸对照品贮备溶液4、5、6 mL。按1.3.1项下操作并进样测定，计算加标回收率。供试品中醋酸的回收率在99.12%～100.59%之间，平均回收率(n= 9)为99.68%，RSD分别为0.48%(表1)。表明方法回收率良好，符合要求。

表1 回收率测定结果Tab 1 Results of recovery tests

2.2.6 检测限与定量限 分别称取0.5 g阴性对照供试品置100 mL量瓶中，再精密吸取浓度为0.112 mg/mL的标准工作液1、3、5、10、15 mL，加入相应量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，照1.3.1项下色谱条件进样检测。按照大于等于3倍信噪比计算检测限浓度，检测限浓度为3.74 μg/mL，S/N值为3.9；按照大于等于10倍信噪比计算定量限浓度，定量限浓度为11.23 μg/mL，S/N值为9.7。

2.2.7 耐用性试验 分别从色谱柱类型、柱温、磷酸水溶液浓度几个方面对方法的耐用性进行考察。

2.2.7.1 色谱柱类型考察 取供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件，分别考察SunFire C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、CAPCELL PAK MG Ⅱ C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、Eclipse XB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、WondaCract ODS-2柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)对被测组分保留时间、分离度、拖尾因子、理论塔板数的影响，结果见表2。

表2 色谱柱类型考察Tab 2 Investigation of chromatographic column types

2.2.7.2 色谱柱柱温考察 取供试品溶液，改变色谱柱柱温分别在25、30、35 ℃进行测定。结果显示，随着柱温升高，醋酸保留时间略有提前，但峰面积、分离度、拖尾因子、理论塔板数基本未发生变化。

2.2.7.3 磷酸水溶液浓度考察 取0.02%磷酸水溶液、0.05%磷酸水溶液、0.1%磷酸水溶液分别与乙腈对供试品进行梯度洗脱，结果显示，磷酸浓度的变化，对醋酸色谱峰的保留时间、峰面积、分离度、拖尾因子、理论塔板数基本无影响。上述耐用性试验结果表明，该方法耐用性良好。

2.3 供试品含量测定 利用新建立的方法及原标准方法分别测定3批复合酚供试品中醋酸的含量，结果见表3。

表3 含量测定结果(n = 3)Tab 3 Test results of samples(n = 3)

3 讨论与结论

3.1 醋酸含量测定方法的确定 现有的醋酸检测方法主要有滴定法[6]、高效液相色谱(HPLC)法[7-8]、离子色谱(IC)法[9-10]、气相色谱(GC)法[11-12]、气相色谱-质谱连用(GC-MS)法[13]等。本研究小组尝试使用上述方法测定复合酚中的醋酸含量，发现滴定法专属性差，影响结果准确性的干扰因素较多；IC法、GC法和GC-MS法均需配备专门仪器，普适性较差； HPLC法通用性强，是目前药物分析最常用的方法之一，解决了复合酚中其他成分的干扰问题，能够较好满足醋酸定量要求。

3.2 色谱条件及检测波长的选择 文献报道采用C18色谱柱测定醋酸所使用的流动相系统主要有调节至规定pH值的磷酸盐缓冲液(纯水相)[14-15]、调节至规定pH值的磷酸水溶液(纯水相)[16-17]、磷酸盐缓冲液/磷酸水溶液-甲醇/乙腈(V/V)[18-19]等。纯水相作为流动相，对色谱柱要求高，最好使用亲水性的C18色谱柱(C18-AQ)；在该条件下使用一般的C18色谱柱容易降低色谱柱寿命。在190～400 nm的波长范围内对醋酸的最大吸收波长进行扫描，其特征吸收在205 nm，接近于紫外末端吸收，乙腈的紫外吸光度值比甲醇更低，能够避免溶剂的基质效应，故选用210 nm作为测定波长，优先选择了乙腈作为流动相的有机相。0.05%磷酸水溶液即可抑制醋酸在水中解离，避免造成色谱峰变宽且对称性变差。最终本研究采用0.05%磷酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，在醋酸出峰之后，提高有机相比例，使供试品中酚类等弱极性的组分能被快速洗脱出来。该条件下系统压力较低，且不会发生有机相高比例时，缓冲盐析出导致管道、色谱柱、流通池堵塞的情况。

3.3 两种检测方法的对比 复合酚中的醋酸及酚类成分均具有挥发性，《兽药质量标准》2017年版化学药品卷中采用水分测定二法(甲苯法)的装置将供试品中的醋酸随着水、甲苯的共沸液蒸出(水和甲苯作为互不相溶的液体二元体系，共沸点低于两者各自组分的沸点。酚类物质的蒸馏温度绝大多数高于100 ℃，此条件下仅有微量蒸出)，冷凝并收集馏液，由于密度不同，馏液在水分测定管中分层，水收集于测定管下层(醋酸溶解在水层)，甲苯收集于水分测定管上层(少量蒸馏出的酚类物质溶于甲苯层)，从而达到分离纯化的目的。标准要求“将测定管中的水层移入具塞锥形瓶中，甲苯层留在管中”，故能否避开甲苯层的干扰、完全转移水层直接关系到实验结果的准确性和平行性。由于测定管下端并无开口，标准又未规定具体的转移方法，故在实际执行过程中，不同的实验人员可能采取不同的方法移取水层，从而导致测定结果的不可控性。由表3测定结果可知，滴定法的测定结果要略低于新建立的HPLC法，且偏差较大。主要由于HPLC法克服了滴定法前处理操作繁琐复杂的缺点，消除了提取过程造成的药物损失，避免了人为因素的影响。因此，高效液相色谱法的准确度更高、可操作性更强。

复合酚现行质量标准中醋酸的测定方法存在一定的局限性,无法对产品质量进行有效控制。本研究建立了HPLC法测定复合酚中醋酸含量的方法，操作简单，专属性强，准确性、重复性、精密度、耐用性良好，并为复合酚制剂标准的完善提供了技术支持。