三种中兽药产品中黄柏薄层色谱无苯展开系统研究

安鹏丽，陈 静，李金超，冯亚文，郭 莉，张 娜，杨彦超，李 楼，武侠均

(1.保定冀中药业有限公司，保定 071500；；2.河北省兽药监察所，石家庄 050035；3.唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山 063000)

三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒三个产品是畜牧养殖行业的常用产品，其标准收录于2017年版《兽药质量标准》(中药卷)[1]。三个产品组方都含有黄柏，在黄柏的薄层色谱鉴别方面，展开剂都使用了苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)。

薄层色谱法是一种简便、快速、微量的分析方法，广泛应用于化学合成、天然药物的定性鉴别和纯度检验中。其中，展开系统是决定薄层色谱分离效果的重要因素。苯价格便宜且分离效果好，在多种药物的薄层鉴别中表现出了优良的性质，但其毒性不容忽视。自职业病实现网络报告以来，苯引起的急、慢性中毒人数一直位居我国职业中毒首位；2017年国际癌症研究中心将苯再次列入人类致癌物清单(Ⅰ类)，同时被我国纳入《国家高毒物品目录》[2]。业内对无苯展开剂的研究不在少数。李正国等[3]人曾用甲苯替代苯，对栀子金花丸中的黄连、黄柏进行薄层鉴别；陈蔼等[4]对使用苯、甲苯为展开剂的多种中药材进行了方法改进，取得了较好的成果；朱弘等[5]对黄连解毒散、香薷散、乌梅散的薄层鉴别进行了无苯展开系统研究，证实以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂能收到良好的分离效果。

鉴于此，研究针对三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒三个常用产品开展了替代苯试剂的薄层鉴别研究，以期找到合适的展开剂，减少苯的使用，保护工作人员，并减少环境污染。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 GoodLook-2000型薄层色谱成像仪，上海科哲生化科技有限公司。

硅胶G薄层板，青岛海洋化工厂分厂，规格100 mm×100 mm，厚度0.20～0.25 mm，批号2020年07月07日、批号2020年05月08日。

硅胶HSG薄层板，烟台江友硅胶开发有限公司，规格100 mm×200 mm，厚度0.2 mm±0.03 mmm，批号020191216。

硅胶HSG薄层板，烟台化学工业研究所，规格200 mm×100 mm，厚度0.25 mm±0.02 mm，批号20200703。

DC-Fertigplatten SIL G-25薄层板，德国MN(MACHEREY-NAGEL)公司，规格10×20 cm，厚度0.25 mm，批号407191。

TLC Silica gel 60薄层板，德国默克公司(Merck KGaA)，规格10 cm×20 cm，批号HX02024426。

玻璃点样毛细管，华西医科大学仪器厂生产，内径0.5 mm。

三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒标方样品及三种产品相应的无黄柏阴性样品，按照国家现行标准《兽药质量标准2017年版中药卷》[1]自制。

盐酸小檗碱对照品(批号110713-201212)、黄柏对照药材(批号121510-201807)，购自中国食品药品检定研究院。

试剂甲醇、正丁醇、冰醋酸、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、乙酸乙酯、环己烷、乙酸乙酯、异丙醇、三乙胺、氨水、正己烷、三氯甲烷均为分析纯，水为纯化水。

1.2 试验方法

1.2.1 方法设计 室温条件下，以硅胶G板为固定相，参照《兽药质量标准2017年版中药卷》《中国兽药典》[6]《中国药典》[7]中黄柏及盐酸小檗碱的相关检测方法，筛选出的4种使用较为广泛的展开剂组合，对三种产品进行薄层色谱分离。若能筛选出分离效果较好的展开剂，则根据斑点分离度及目标斑点比移植等进一步优化其配比，使其能够达到最佳的分离效果。若备选项均不能达到有效分离，则另外探索新的试验方法。筛选的4种展开方法如下：

方法一：正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)[1]

方法二：乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)[7]

方法三：乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上层溶液[7]

方法四：环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)，氨蒸气预饱和20 min[6，8]

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 三黄散 取三黄散标方样品0.3 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，滤过，滤液作为供试品溶液。取不含黄柏的阴性对照样品，同法制备三黄散阴性对照样品。

1.2.2.2 公英青蓝合剂 取公英青蓝合剂标方样品2 mL，水浴蒸至近干，放冷，加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取不含黄柏的阴性对照样品，同法制备公英青蓝合剂阴性对照样品。

1.2.2.3 公英青蓝颗粒 取公英青蓝颗粒标方样品5 g，加甲醇5 mL使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。取不含黄柏的阴性对照样品，同法制备公英青蓝颗粒阴性对照样品。

1.2.2.4 对照药材与对照品 取黄柏对照药材0.1 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，滤过，取滤液作为对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3 点样、展开与显色 分别取三黄散阴性样品、对照品、对照药材、三黄散标方供试品溶液各2 μL，公英青蓝合剂阴性样品、对照品、对照药材、公英青蓝合剂标方供试品溶液各1 μL，公英青蓝颗粒阴性样品、对照品、公英青蓝颗粒标方供试品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G板上，按照1.2.1项下设计方法展开，展距8 cm，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

2 结果与分析

2.1 方法一(正丁醇-冰醋酸-水系统)结果 由图1可见，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂对三药进行薄层色谱分离，三黄散与公英青蓝合剂分离度不够，公英青蓝颗粒背景模糊，与上下斑点之间轮廓不够清晰。再者，该方法展开需时较长，展距8 cm约需2～2.5 h，不是首选方法。

A：三黄散展开图(1.阴性对照；2.盐酸小檗碱对照品；3.黄柏对照药材；4.三黄散标方样品)B：公英青蓝合剂展开图(1.阴性对照；2.盐酸小檗碱对照品；3.黄柏对照药材；4.标方样品)C：公英青蓝颗粒展开图(1.阴性对照；2.盐酸小檗碱对照品；3.标方样品)以下均相同图1 正丁醇-冰醋酸-水系统对三药分离效果Fig 1 Separation effect for all the three drugs withn-butanol-glacial acetic acid-water system

2.2 方法二(乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系统)结果 以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶7∶1∶1)为展开剂对三药进行薄层色谱分离，三黄散的阴性样品存在干扰，公英青蓝合剂与公英青蓝颗粒条带中主斑点与上下的蓝色斑点分离度低，该方法不适用。

图2 乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水系统对三药分离效果Fig 2 Separation effect for all the three drugs with ethyl acetate-butanone-formic acid-water system

2.3 方法三(乙酸丁酯-甲酸-水系统)结果 由图3可见，以乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上层溶液为展开剂，三黄散与公英青蓝合剂阴性样品不存在干扰，但是公英青蓝颗粒在主斑点处存在干扰，三者分离度都较差。

图3 乙酸丁酯-甲酸-水系统(上层溶液)对三药分离效果Fig 3 Separation effect for all the three drugs with butyl acetate-formic acid-water system (the upper solution)

2.4 方法四(环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺系统)结果 由图4可见，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)为展开剂，三药分离度尚可，但是三黄散的阴性样品存在干扰，主斑点与一个红色斑点重合；4B与4C间对比，可明显看出该方法对盐酸小檗碱主斑点的展开效果不稳定，主斑点出现的位置受温度、湿度及加入氨水的量等多个因素干扰，重现性极差。因此该方法不适用于三种目标产品的薄层分离。

图4 环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺系统对三药分离效果Fig 4 Separation effect for all the three drugs with cyclohexane-ethyl acetate-isopropanol-methanol-water-triethylamine system

2.5 方法改进 由于上述四种来自药典的展开系统未能达到理想的分离效果，后期进行了多种组合的尝试，最终确定了新的展开系统：正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)。该系统对三种药物的分离效果如图5。

(使用青岛海洋2020年07月07日批次薄层G板)图5 正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水系统对三药分离效果Fig 5 Separation effect for all the three drugs with n-hexane-chloroform-butanone-ethyl acetate-formic acid-water system

由图可见，三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒三种药物使用该展开系统，分离度高，斑点轮廓清晰，效果良好。

除斑点的形态和分离度指标外，比移植Rf也是薄层色谱法的基本定性参数。

比移值Rf=原点到斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

当色谱条件一定时，组分Rf是一常数，其值在0～1之间，可用范围是0.2～0.8，最佳范围是0.3到0.5。物质不同，结构和性质各不相同，其Rf也不同。因此，利用Rf可以对物质进行定性鉴别[9]。

原点到溶剂前沿的距离即为展距，本试验中薄层板高10 cm，展距在8 cm，多次重复证实，目标斑点位置距离原点在3.3～5 cm之间，受展开剂饱和时间、温湿度、不同硅胶板批次的影响稍有变动。计算目标斑点的比移值Rf介于0.41～0.62之间，各斑点之间分布较为均匀，方法稳定。

2.6 方法验证 以正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)为展开剂，对三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒的样品进行薄层色谱分离，分别使用青岛海洋2020年5月8日(图6-1)及2020年7月7日生产的硅胶G板重复试验，后者分离效果稍好于前者；使用德国默克公司G板HX02024426批次(图6-2)、德国MN公司G板407191批次(图6-3)，以及烟台江友HSG板020191216批次(图6-4)、烟台化工HSG板20200703批次(图6-5)重复，均能达到更好的分离效果。

3 讨论与结论

苯属于一类溶剂，对人体和环境的危害很大，国内外实验室均已避免使用。2005年版《中国药典薄层色谱彩色图谱集》中已经将苯改为甲苯，但该展开系统不稳定，存在重现性差的问题[10]。研究在改进三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒三种药物中黄柏的薄层色谱鉴别展开剂的研究过程中，试验了多种相关药物应用的不同展开剂，如使用三氯甲烷-甲醇-浓氨(5∶0.6∶0.3)(苦参药材鉴别)、二氯甲烷-丁酮-甲酸-水(10∶1∶0.1∶0.1)(布渣叶药材鉴别)等为代表的展开剂，酸/碱的含量较低，盐酸小檗碱主斑点滞留在原点不发生移动，但是提高展开剂中酸或碱的含量至10%左右，则目标斑点能够随展开剂上行，且经过对比证明，甲酸比乙酸、氨水、三乙醇胺等分离度好。虽然经过几十次尝试仍未找到直接可用的展开剂组合，但是发现了这三种产品在分离过程中有共同点：①主斑点的分离需要在酸或碱性环境下进行；②三氯甲烷能够使主斑点上升到无干扰的高度；③三氯甲烷展开的主斑点形态有拖尾，乙酸乙酯能改善斑点形态；④加入少量水能够使Rf值适中。

经过尝试，最终确定了新的展开系统：正己烷-三氯甲烷-丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水(3∶9∶6∶3∶4∶0.5)。经过不同温湿度条件下的多次重复试验证明，该展开系统分离度高，重现性好，专属性强，展距8 cm整体耗时在30～40 min；所用试剂均为常规试剂，毒性小，且对饱和时间无严格要求，是一种很稳定的展开剂系统。该系统可为三黄散、公英青蓝合剂、公英青蓝颗粒和其它以盐酸小檗碱为主要成分的中药材及成方制剂薄层色谱鉴别提供参考。