土壤中抗生素多残留污染现状及前处理方法研究进展

陈 晨，李秀波，王宏磊，刘义明

(中国农业科学院饲料研究所，国家饲料药物基准实验室，北京 100081)

兽用抗生素可以抑制病原微生物的生长，从而治疗在养殖过程中畜禽产生的各种疾病，提高动物性食品的产量与质量。据统计我国平均每年约有上千万吨的兽药广泛应用于动物疾病治疗、预防和畜禽饲料添加剂等多个方面。但作为环境污染物，这些抗生素会有30%～90%以原形或代谢物形式从粪便中排出体外从而被直接施入农田[1-2]，且残留时间较长，在土壤中进行残留积累[3]。土壤中累积的兽药一方面会破坏土著微生物菌落，诱导产生抗性细菌以及耐药性细菌，从而使土壤环境中的抗生素抗性基因丰度增加以及产生耐药性细菌[4-5]。国内外研究表明，即使是污染较轻的地区也同样检测出含有氟喹诺酮类药物等大量抗性基因[6-7]。另一方面，抗生素还会联合土壤中的其他离子，影响土壤中生物群落的多样性以及生物学的功能。形如磺胺甲恶唑与铜离子同时在土壤中存在的情况下会显著降低土壤中总磷脂脂肪酸、细菌磷脂脂肪酸和真菌磷脂脂肪酸的含量[8]。另外土壤中的抗生素还可以通过食物链产生生物富集，对人类的健康带来严重的危害[9]。因此,研究者对兽药在环境土壤中的检测技术越来越重视，针对复杂的土壤基质开发出了不同的前处理技术。本文概述了国内外重点地区的环境土壤中兽药污染现状，同时系统总结了近年来土壤样品中兽药靶向与非靶向筛查方法的样品前处理技术，并对相关技术进行了比较和展望，以期望促进兽药检测方法的开发以及环境土壤中兽药含量的检测。

1 土壤中兽用抗生素的来源

兽用抗生素在所有的抗生素使用中占有很大的比重。据统计，全球约有70%的抗生素使用在畜牧养殖行业，每年有超过9.7万吨的抗生素投入畜禽养殖业中[10-11]。大量兽用抗生素的使用成为环境土壤中抗生素的主要来源。环境土壤中兽药的输入途径主要有两种：一是有机肥在土壤中直接施肥造成土壤中兽药抗生素污染；二是使用污染的水资源对农田进行灌溉。其走向流路可以概括为图1。

图1 土壤中兽用抗生素的来源流程图[23-24]Fig 1 Flow chart of antibiotic source[23-24]

1.1 施肥 随着集约化养殖环境的迅速发展，含有各种抗生素的畜禽粪便量也不断增加。这些粪便中的抗生素虽然会因为堆肥等处理手段降解一部分[12]，但是单纯的堆放处理抗生素降解不显著[13-14]，在养殖场的粪便中仍然检测出大量的抗生素，特别是四环素类与喹诺酮类。其中环丙沙星、强力霉素和土霉素的最高含量超过1000 μg/kg[15]。这种被污染的粪便直接施用于土壤或者是经过处理制成有机肥施用于土壤都会造成土壤中兽药抗生素的残留，经过累计以及生物链的富集，从而流向人体，对人类以及整个生态系统产生威胁。有研究表明相对于不使用猪粪的土壤，长期使用猪粪的稻田表层土壤中四环素含量具有明显的累积现象，浓度范围为：ND～344.74 μg/kg，且长期使用猪粪会造成稻田表面的抗性基因的丰度显著升高[16]。

1.2 灌溉 兽药抗生素在水产养殖中也广泛使用[17]。我国很多淡水养殖地区的养殖水体中已经有一定量的磺胺类和喹诺酮类抗生素的残留，并可能威胁到水生生物的安全[18-19]。其被污染过的水质直接流入水体或沉降富集于底泥中造成环境水的污染[20]，被污染的环境水资源在对农田等进行灌溉的时候就会造成土壤中不同程度的兽药抗生素累积[21-22]。

2 土壤中兽用抗生素的污染状况

在我国的各个区域内的土壤中都不同程度的检出了兽药抗生素残留。其中包括畜禽养殖场周边土壤、蔬菜基地和城市土壤等。有研究指出城市土壤中的抗生素浓度高于农业土壤[25]。检出量最多的抗生素有四环素类、喹诺酮类和磺胺类，有的甚至已经超出了兽药国际协调委员会(VICH)筹划指导委员会提出的土壤抗生素毒害效应的触法值(100 μg/kg)，具有一定的生态风险。但是各个地方土壤中的抗生素检出浓度具有较大的差异，发生重大差异的原因可能是因为每个地方的施肥与灌溉的习惯不同。有文献指出环境土壤中兽药抗生素残留的含量与土壤采集的深度、使用不同动物粪便施肥都有很大的关系[26]。Gu等指出徐州市畜禽养殖场土壤中氟喹诺酮类抗生素和大环内酯类化合物的总浓度远高于磺酰胺类[27]。氟喹诺酮类与大环内酯类抗生素在土壤中降解较慢，吸附性较长，能在土壤中稳定的存在。四环素类抗生素由于其广谱性与价格低廉所以广泛应用畜牧养殖业中，但是这些抗生素不能完全被机体吸收，而大部分以原形或者代谢产物的形式从体内排出，并随着农用最终在土壤中进行吸附积累，进而危害农业生态安全。农业土壤中四环素类抗生素已经成为当前农业环境污染及生态安全研究的热点之一。具体的检出情况如表1所示。

表1 抗生素在环境土壤中的残留浓度Tab 1 Residual concentration of antibiotics in Environmental Soil

3 土壤中兽用抗生素的检测前处理技术

兽用抗生素残留的检测方法主要有免疫分析法与仪器分析法，但是在检测之前样品的制备一直作为整个药物残留检测的关键环节，因为检测兽药残留的基质成分比较复杂，基质效应影响比较严重，另外药物以及其代谢产物各种物理化学性质不同，在不同的酸碱浓度下显示不同的电离特性[39]，从而对前处理的条件要求比较严苛。由于干扰兽药多残留分析的原因比较多，且在建立以及优化兽药残留预处理方法的时候，必须考虑减少使用有机化学溶剂，从而减少对环境的污染，除此以外，良好的预处理方法要尽可能减少其消耗的时间、精力、以及成本，提高被检测目标的回收率。所以很多年来，药物多残留分析中样品预处理方法一直是检测的瓶颈之一。近些年来，因为人们对兽药残留含量的关注度较多，对残留兽药的认识更加深刻，所以针对兽药残留建立了大量的预处理方法。传统的预处理技术有：固相萃取法、QuEChERS、加速溶剂萃取法、液-液萃取法、索氏提取法、超声波提取法等。土壤基质比较复杂，其中1%～10%动植物腐烂而形成的土壤腐殖质，还有岩石风格所形成的矿物质。近十年来开发的方法中使用的提取液大多数都选择了EDTA-柠檬酸缓冲液，其在检测不同土质的时候也仅仅只是优化了柠檬酸盐缓冲液与有机溶剂。选择EDTA-Mcllvaine缓冲液提取土壤中抗生素及其降解产物，其原因也是因为避免兽药抗生素与金属离子发生螯合作用，从而增加兽药的提取效果。由于土壤基质中的干扰物较为复杂,往往会与待测的喹诺酮类抗生素在雾滴表面离子化过程中产生竞争,进而影响电喷雾接口处的离子化效率,即产生基质效应。因此，为尽量避免基质效应降低测定方法的准确度，样品的前处理条件优化至关重要。

3.1 固相萃取技术 固相萃取技术(solid-phase extraction，SPE)是一项常用的对目标物质进行分离、浓缩、净化和介质交换的同时具有多功能的样品预处理技术，广泛用于卫生，环境，制药，临床，食品和工业化学等领域，目前是土壤中兽药抗生素多残留检测最常用的前处理净化方法。大多数研究都使用超声震荡提取与该技术连用，随后通过SAX与HLB小柱串联的前处理方法[40-41]。郭欣妍等利用磷酸盐缓冲液：乙腈=1∶1超声萃取，SAX-HLB串联固相萃取柱净化与富集，检测土壤中喹诺酮类、磺胺类、四环素类、大环内酯类和内酰胺类5类25种抗生素，回收率为51.3%～86.4%。并且串联SAX强阴离子交换柱后，土壤样品的基质效应降低为75%～160%之间[40]。SUN利用加速溶剂提取与SAX-HLB串联固相萃取连用技术对土壤中的四环素类、大环内酯类与磺胺类抗生素进行提取。多种技术连用大大减少了土壤基质效应，回收率均在67.3%～97.4%之间[42]。曹胜男等使用甲醇：EDTA=1∶1溶液提取，超声提取与SPE净化，对施粪土壤中四环素类、喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类4类15种兽药抗生素进行提取，四环素类的加标回收率为73.2%～97.4%，磺胺类为71.7%～108.4%，喹诺酮类为78.1%～112.8%，大环内酯类回收率为81.2%～98.6%[43]。SPE技术在检测土壤中兽药抗生素多残留的应用见表2。

表2 固相萃取技术在环境土壤中多类兽药残留同时分析中的应用Tab 2 SPE technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

续表

3.2 QuEChERS技术 QuEChERS是Anastassiades等[44]在2003年开发的一种消耗时间少，花费少的一种新型的前处理技术。起初应用于蔬菜中农药的多残留检测，后来因为操作方便，被引用到兽药残留等各个领域中。QuEChERs前处理技术可以利用吸附填料与基质中的杂质相互吸引，从而有效地去除检测物中的有机酸、糖类、多环芳烃等成分，使被检测物质回收率良好，该方法在基质比较复杂的土壤兽药抗生素的检测中更实用。QuEChERS技术与SPE技术相似，先使用提取液进行提取，而后进行浓缩，与SPE技术的不同之处在于它选用的是合适的具有吸附作用的QuEChERS盐包作为吸附剂，例如C18粉[45]，石墨烯、碳纳米材料等，对药物或者杂质进行吸附，使被检测物回收率提高的同时减少基质效应所产生的影响。有研究表明，相比于固相萃取技术，QuEChERs更加方便，同时回收率更好[46]。使用QuEChERs检测土壤中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类、林可胺类，其在添加范围内线性关系良好，而且回收率都可以达到61%～118%[46-49]。在进行土壤中兽药抗生素等多残留分析时，除了环丙沙星、马波沙星等氟喹诺酮类、莫能菌素回收率很低以外，其他抗生素使用QuEChERS提取的结果均优于加压萃取技术。且相比于加压萃取技术，QuEChERS更适合分析大环内酯类阿奇霉素和替米考星、硝基咪唑类、四环素类和链霉素维吉尼亚霉素[50]。QuEChERS技术在检测土壤中兽药抗生素多残留的应用见表3。

表3 QuEChERS技术在环境土壤中多类兽药残留同时分析中的应用Tab 3 QuEChERS technology in the soil of the veterinary antibiotics residue

QuEChERs净化技术在检测其他基质的兽药多残留方面已有应用报道，但目前在土壤基质中同时检测多类药残留方面的研究不多。但其操作简单，回收率好，重复程度好，其在未来将很好的应用于土壤中兽药抗生素的检测。

3.3 液-液萃取技术 液-液萃取技术(liquid-liquid extraction，LLE)主要通过目标待测物质在不同的两种液体中的溶解度不同而提取，其具有提取和净化两种作用。陈海燕等利用0.1 mol/L氢氧化钠：甲醇=5∶5提取，二氯甲烷萃取，经过高效液相色谱-荧光检测器检测土壤中三种磺胺类的兽药抗生素，回收率为74.17%～104.35%，同时检测线可以达到2.5 μg/kg[51]。另外还有SUN[52]使用LLE技术检测土壤中的喹诺酮类抗生素，其回收率也都大于90%，且批内与批间变异均不超过5%。但是相对于其他的前处理方法，液-液萃取技术在进行土壤中兽药抗生素多残留检测时，一般仅仅适用于同一类的兽药抗生素，目前针对土壤中多类多种兽药抗生素的检测使用液-液萃取技术的鲜有人研究。况且液-液萃取需要较多的有机试剂，这对环境会造成更进一步的破坏。

3.4 加速溶剂萃取技术 加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction，ASE)又称加压液相萃取(PLE)，其全自动程度很高，可以连续的进行提取过滤。在高温高压的条件下，提高目标兽药抗生素在提取剂中的溶解度，从而提高前处理的回收率。孙宝利等建立了一种ASE-HPLC-MS/MS检测方法用于测定土壤中四环素类抗生素残留含量，回收率均在60.1%～103.8%之间，相对标准偏差在2.6%～4.8%之间[53]。杨静等联合加速溶剂萃取与固相萃取技术，检测土壤中的6种喹诺酮类的抗生素，将基质效应因子控制在0.84～1.04之间，且回收率在60.9%～89.9%，很好的减少了土壤基质对质谱检测器产生干扰问题[54]。Marie-Virginie Salvia[55]利用甲醇∶乙腈∶0.2M柠檬酸(pH=4.5)=40∶40∶20(V/V/V)提取液，经过快速溶剂萃取，利用LC-MS/MS检测土壤中喹诺酮类和四环素类抗生素，回收率喹诺酮类>87%，但是四环素类回收率在在25.4%～41.7%之间。所以快速溶剂萃取技术比较适用于检测土壤中同一类的兽药抗生素。但是同时检测多类的抗生素时，效果不是很理想。

4 展 望

环境土壤中的抗生素残留检测技术还处于正在发展的阶段，面临着一系列的问题。常用的检测手段有理化检测手段分析与免疫检测。在市面上常见的快检方法ELISA、胶体金等使用针对一种靶标物的检测，不能满足对多兽药残留的高通量多元分析要求。色谱-质谱联用方法虽然灵敏度高，但是实验室条件要求比较高，操作复杂，费时费力，成本比较高，尽管在多残留检测手段中出现了定量检测的生物芯片技术，达到样品前处理的集成化以及操作灵敏度与特异性来说相对较好，但是液质联用仍然是现阶段最常用的技术。本文针对近十年土壤中抗生素的检测方法相互比较，从前处理的提取液、前处理技术等多方面进行阐述。土壤中兽药抗生素的检测现状：一是开发优化的方法比较单一，大多数开发方法还集中于提取液以及萃取技术的优化；二是现在大多数的环境中兽药抗生素的检测方法还都处于靶向的检测，针对非靶向检测技术还不成熟，因为土壤中的兽药种类复杂，含量较多。所以非靶向的检测技术的发展有利于环境中土壤中的抗生素含量的检测，非靶向的检测技术的发展就需要非靶向的谱图库的建立。

综上所述，高分辨质谱是环境土壤中抗生素检测的强有力的工具，但是在该检测技术下还需要更多的研究：①高分辨质谱分析技术在环境水样品中已经开始逐渐发展，但是在土壤中的环境检测还鲜有报道，所以使用高分辨质谱对土壤样品的前处理净化过程还需要进一步发展探索，同时在前处理过程中考虑多种提取净化步骤连用是将来的发展趋势；②高分辨的非靶向技术在环境中已经开始发展起来，国内已经发布了关于高分辨质谱检测水环境中兽药的国家标准[69]，但是在土壤中的关注度还是比较低，所以高分辨质谱的检测技术相关标准制定，或者是非靶向的抗生素筛查将是未来发展的方向。