表达H5N1亚型禽流感HA、NA、M1基因的重组杆状病毒的鉴定

李晶梅，陈鲁杰，王焕君，李 改，朱 薇，张飞雁，石宝兰，漆世华，谢红玲

(1.国药集团动物保健股份有限公司，武汉 430075；2.诺华生物科技(武汉)有限责任公司，武汉 430075)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病,其中的H5N1亚型禽流感是危害最大的禽类疫病之一。疫苗能有效防控该疫病，现阶段主要应用的是鸡胚工艺或细胞培养工艺制备H5N1亚型禽流感病毒，进而生产全病毒灭活疫苗。全病毒灭活疫苗需在生物安全三级的生产车间生产，生产成本较高，因此广大研究者一直在探寻新型疫苗研发方向[1]。

昆虫杆状病毒表达系统是一种能够高效表达外源基因的真核表达载体系统[2]。昆虫杆状病毒不感染脊椎动物，无生物安全隐患；基因组较大可容纳大片段外源基因；能对表达的蛋白进行加工修饰，使表达的蛋白保存原有的生物活性[3]。有研究表明该系统表达流感病毒的 HA、NA、M1 蛋白可自我包装成形态类似于禽流感病毒的病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)[4]。VLPs具有较好的免疫原性，有开发成为疫苗产品的可能。

为研究基于该系统构建的含有H5N1亚型禽流感HA、NA、M1基因的重组杆状病毒(简称“VLP01株”)，其表达产物是VLPs，还是游离的HA、NA、M1等蛋白，对表达产物进行了血凝、电镜、Western Blot、ELISA鉴定，以确定其性质。

1 材料和方法

1.1 毒种、细胞 VLP01株毒种由诺华生物科技(武汉)有限责任公司提供，国药集团动物保健股份有限公司扩繁并保存；Sf9细胞由国药集团动物保健股份有限公司扩繁并保存。

1.2 主要试剂 H5N1 HA重组蛋白、H5N1 NA重组蛋白、H7N9 M1重组蛋白，Sino Biological公司产品；禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验(Re-6)抗原(简称“H5禽流感病毒”)，哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品；HA单抗，由国药集团动物保健股份有限公司研制；NA多抗，abcam公司产品；M1单抗，santa cruz biotechnology公司产品；HRP羊抗鼠IgG和HRP羊抗兔IgG，KPL公司产品；DAB显色试剂盒，武汉博士德公司产品；TMB显色液，湖州英创生物科技有限公司产品；蛋白Marker，Thermo Scientific公司产品。

1.3 主要设备耗材 超速离心机，Beckman公司，水平转子sw41Ti，角转子 TyPe0ToTi；20 mL超滤浓缩离心管，50000MWCO，Vivaspin公司产品。

1.4 制备表达产物 毒种接种Sf9细胞，27 ℃培养4 d，3000 r/min 20 min离心收获上清即为表达产物。

1.5 超速离心纯化表达产物 角转子离心表达产物，4 ℃ 28000 r/min 2 h。弃去上清，沉淀中加入PBS，震荡悬浮后过夜，制成均匀混悬液。配制蔗糖密度梯度离心溶液，蔗糖密度分别为20%、60%，水平转子离心混悬液，4 ℃ 28000 r/min 3 h。吸取目的条带即为纯化产物。

1.6 血凝效价检测 检测表达产物、角转子离心上清、混悬液、纯化产物的血凝效价，血凝检测的方法参照《中华人民共和国兽药典2015版第三部》附录27[5]。

1.7 电镜检测 纯化产物以超滤浓缩离心管脱糖，加至铜网上，2%磷钨酸染色液负染，透射电镜观察VLPs的形态。

1.8 Western Blot检测 纯化前表达产物、纯化后表达产物、H5禽流感病毒(对照)和H5N1 HA重组蛋白(HA蛋白标准品)经10% SDS-PAGE电泳后电转至NC膜，用HA单抗作为一抗、HRP羊抗鼠IgG作为二抗、DAB染色液显色，鉴定HA蛋白。同法用NA多抗鉴定NA蛋白，用M1单抗鉴定M1蛋白。

1.9 ELISA检测 用NA兔多抗作为包被抗体、HA鼠单抗作为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法，并以此方法检测表达产物。包被捕获抗体：加入NA多抗，200 ng/孔，100 μL/孔，2～8 ℃孵育过夜，PBST 洗板。封闭：加入含5%脱脂乳的PBS，250 μL/孔，37 ℃封闭 2 h，PBST 洗板。加样：在酶标板相应孔中加入适当稀释的表达产物、H5禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白，100 μL/孔，3个重复，37 ℃孵育1 h，PBST洗板。加检测抗体：加入HA单抗，500 ng/孔，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗板。加酶标二抗：加入HRP羊抗鼠IgG工作液，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗板。加显色液：加入TMB显色液，100 μL/孔，室温反应10 min。加终止液：加2 mol/L硫酸，50 μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm的值。PBS各孔OD450nm值的平均数+3倍标准差为阴阳性判定的临界值，OD450nm≥临界值，判为阳性；OD450nm<临界值判为阴性。

2 结果与分析

2.1 血凝效价检测 表达产物、角转子离心上清、混悬液、纯化后表达产物的血凝效价和体积见表1。超速离心后有血凝活性的物质在沉淀中而不在上清中。

表1 被检样品血凝效价和体积Tab 1 HA titer and volume of the samples

2.2 电镜检测 如图1所示，电镜下可见禽流感病毒形态特点的VLPs，呈圆形或椭圆形，直径约100 nm，外周有环形的冠状刺突。

图1 纯化后样品电镜照片Fig 1 Observation of the purified sample by electron microscopy

2.3 Western Blot检测 用HA、NA、M1抗体分别检测纯化前表达产物、纯化后表达产物、H5禽流感病毒及HA、NA、M1蛋白标准品。

2.3.1 HA抗体检测HA蛋白 纯化前后的表达产物、H5禽流感病毒、HA蛋白标准品在70 kD左右有目的条带，见图2。H5禽流感病毒HA蛋白的条带弱，可能因为甲醛灭活导致抗原表位被部分破坏，未被HA抗体全部识别。表达产物、H5禽流感病毒、HA蛋白标准品的HA蛋白的分子量有差异，可能因为表达的系统不一样，表达产物是昆虫杆状病毒系统表达的，HA蛋白标准品是原核表达系统表达的，而H5禽流感病毒是鸡胚扩繁制备的。

1：H5禽流感病毒；M：Marker；2：纯化后的表达产物；3：纯化前的表达产物；4：HA蛋白标准品1: H5 AIV；M: Marker；2: Purified products；3: Unpurified products；4: HA protein图2 Western Blot检测HA蛋白Fig 2 Detection of HA protein by Western Blot

2.3.2 NA抗体检测NA蛋白 纯化前后的表达产物、H5禽流感病毒、NA蛋白标准品在50 kD左右有目的条带，见图3。

1：纯化前的表达产物；M：Marker；2：纯化后的表达产物；3：NA蛋白标准品；4：H5禽流感病毒1: Unpurified products；M: Marker；2: Purified products；3: NA protein；4: H5 AIV图3 Western Blot检测NA蛋白Fig 3 Detection of NA protein by Western Blot

2.3.3 M1抗体检测M1蛋白 纯化前后的表达产物、H5禽流感病毒、M1蛋白标准品在27 kD左右有目的条带，见图4。

1：H5禽流感病毒；M：Marker；2：纯化后的表达产物；3：纯化前的表达产物；4：M1蛋白标准品1: H5 AIV；M: Marker；2: Purified products；3: Unpurified products；4: M1 protein图4 Western Blot检测M1蛋白Fig 4 Detection of M1 protein by Western Blot

2.4 ELISA检测 预实验研究显示，表达产物中有影响ELISA检测结果准确性的物质，所以样品需经透析处理。ELISA方法检测表达产物、H5 禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白，OD450nm值见表1，经计算样品阴阳性判定标准为0.164。结果显示，不同批的表达产物为阳性，H5禽流感病毒和HA蛋白、NA蛋白均为阴性。结果说明，表达产物为同时含有禽流感HA、NA蛋白的VLPs。H5 禽流感病毒的ELISA检测结果为阴性，结合2.3.1的结果，分析原因可能是甲醛灭活的H5禽流感病毒无法被HA单抗有效识别。

表2 ELISA检测表达产物Tab 2 Detection of the products by ELISA

3 讨论与结论

昆虫细胞的小规模和大规模培养都相对容易，因此，昆虫杆状病毒表达系统成为了最广泛的应用于重组蛋白的常规生产系统之一[6]。昆虫细胞可以折叠、修饰、运输和组装新合成的多肽，产生高度真实的可溶性最终产物[6]，因此，将其作为疫苗的抗原生产系统在工艺和抗原性方面均满足要求。

VLP01株是基于昆虫杆状病毒表达系统构建的含有H5N1亚型禽流感HA、NA、M1基因的重组杆状病毒，以禽流感疫苗研发为目的。为确认VLP01株表达产物是禽流感VLPs，对表达产物进行了鉴定。角转子超速离心后有血凝活性的物质在沉淀中不在上清中，说明有血凝活性的物质是可被超离沉淀的、沉降系数700～800 s的禽流感VLPs，而非沉降系数小于20 s、不能被超离沉淀的HA蛋白。禽流感病毒形态上为不规则球形，100 nm左右，包膜上有两种糖蛋白，即血凝素和神经氨酸酶，这两类蛋白突出病毒体外，长度约为10～14 nm，直径6～8 nm，被称作刺突[7]。电镜观察本研究纯化后的表达产物，可见上述大小的病毒样颗粒及表面的环形冠状刺突，说明表达产物具有禽流感病毒的形态特点，是禽流感VLPs。HA、NA、M1抗体以Western Blot方法检测蔗糖密度梯度方法离心纯化的表达产物，可见特异性条带，说明纯化后的表达产物是同时含有HA、NA、M1蛋白的禽流感VLPs。NA多抗、HA单抗的夹心ELISA检测表达产物为阳性，说明表达产物并非游离的HA蛋白、NA蛋白，而是同时含有HA蛋白、NA蛋白VLPs。

血凝、电镜、Western Blot、ELISA鉴定均说明VLP01株表达产物是形态结构类似禽流感病毒的禽流感VLPs而非游离的HA、NA等蛋白。开展的其他研究显示，基于VLP01株的禽流感VLPs疫苗在靶动物上一次免疫能够产生不低于6log2的血凝抑制抗体，并可抵御相同分支的H5N1禽流感病毒的攻击，不发病、不排毒，即禽流感VLPs具有禽流感病毒相似的免疫原性。综上，昆虫杆状病毒表达系统构建的重组杆状病毒载体禽流感疫苗有被开发成为新型禽流感疫苗产品的可能。