蟛蜞菊内酯通过调控miR-142-3p表达对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

郑大炜，代 岩，郭 娜，党 强，路 尧，张 鹏，孙 辉，王春侠

(河南省南阳市中心医院 呼吸与危重一科，河南 南阳473000)

肺炎链球菌是引起社区获得性肺炎的主要原因，肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应是肺炎的主要病理变化[1-2]。研究表明中药具有广谱抗菌，调节免疫，简便价廉等特点，是治疗肺炎的良好途径[3]。通过中药抑制肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应可有效防治肺炎。蟛蜞菊内酯(Wedelolactone，WEL)是菊科植物墨旱莲的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化和降血脂等作用[4]。研究报道蟛蜞菊内酯可以减轻过氧化氢引起的血管内皮细胞氧化应激损伤[5]。蟛蜞菊内酯可以通过抑制NF-κB活化，进而减少炎性细胞因子IL-6、TNF-α的生成，从而抑制脂多糖所致的RAW264.7细胞炎症反应[6]。蟛蜞菊内酯可通过增强PKA信号传导来促进NLRP3的Ser/Thr磷酸化，从而抑制炎症小体的活化和凋亡[7]。以上研究表明蟛蜞菊内酯具有显著的抗炎及抗细胞损伤的作用，然而蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应的影响及机制尚不清楚。研究发现miR-142-3p参与调控炎症反应及免疫细胞功能，与炎症性疾病相关，有望成为免疫炎症性疾病治疗的新靶点[8]。miR-142-3p过表达可通过下调Cox-2表达抑制博莱霉素诱导的肺上皮MLE-12细胞凋亡和炎症[9]。miR-142-3p通过靶向TAB2减轻大肠杆菌衍生的脂多糖诱导的急性肺损伤[10]，miR-142-3p可能参与肺部细胞凋亡、炎症及损伤等。因此，本实验旨在研究蟛蜞菊内酯是否通过调控miR-142-3p影响肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应。

1 材料与方法

1.1 材料

肺泡上皮细胞A549购自中国科学院细胞库，肺炎链球菌购自美国ATCC；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；蟛蜞菊内酯(HPLC≥98%)购自上海吉至生化科技有限公司；IL-10、IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒购自艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、蛋白提取试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 细胞处理与分组

肺泡上皮细胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养；取对数生长期A549细胞，将其用1×108CFU/ml的肺炎链球菌培养细胞，作为感染组，不作处理的细胞作为对照组；将10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L蟛蜞菊内酯预处理A549细胞后用1×108CFU/ml的肺炎链球菌培养，作为蟛蜞菊内酯低、中、高浓度组(感染组+WEL-L、M、H)；将miR-NC、miR-142-3p转染至A549细胞后用1×108CFU/ml的肺炎链球菌培养，记为感染组+miR-NC组、感染组+miR-142-3p组；将anti-miR-NC、anti-miR-142-3p转染至A549细胞后用40 μmol/L蟛蜞菊内酯和1×108CFU/ml的肺炎链球菌培养，记为感染组+WEL+anti-miR-NC组、感染组+WEL+anti-miR-142-3p组。

1.3 IL-10、IL-6表达的检测

取1.2中各组细胞，培养24 h后收集细胞培养上清液，用ELISA法检测IL-10、IL-6水平，具体步骤按照试剂盒操作进行。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞，用预冷的PBS漂洗，用结合缓冲液重悬，加入10 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混匀，避光孵育10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达

提取细胞总蛋白，定量，取50 μl蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF上，用5%的牛血清蛋白封闭1 h；加入一抗4℃过夜，加入二抗室温培养1 h，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J软件分析蛋白条带灰度水平，蛋白表达水平等于目的条带和GAPDH条带的比值。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-142-3p表达水平

提取细胞总RNA，合成cDNA后以U6为内参进行PCR扩增，相对表达量采用2-△△Ct法计算。miR-142-3p上游引物序列：5’-TGCGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞炎症因子表达的影响

与对照组比较，感染组肺泡上皮细胞中IL-10水平降低，IL-6水平升高(P<0.05)；与感染组比较，蟛蜞菊内酯低、中、高浓度组肺泡上皮细胞中IL-10水平升高，IL-6水平降低，且呈浓度依赖性(P<0.05)(表1)。

表1 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞炎症因子表达的影响

2.2 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的影响

与对照组比较，感染组肺泡上皮细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(P<0.05)；与感染组比较，蟛蜞菊内酯低、中、高浓度组肺泡上皮细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，且呈浓度依赖性(P<0.05)(图1，表2)。

表2 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的影响

图1 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的影响

2.3 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞miR-142-3p表达的影响

与对照组比较，感染组肺泡上皮细胞中miR-142-3p表达水平降低(P<0.05)；与感染组比较，蟛蜞菊内酯低、中、高浓度组肺泡上皮细胞中miR-142-3p表达水平升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)(表3)。

表3 蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞miR-142-3p表达的影响

2.4 miR-142-3p过表达对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的影响

与感染组+miR-NC组比较，感染组+miR-142-3p组miR-142-3p表达水平升高，IL-10水平升高，IL-6水平降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低(P<0.05)(图2，表4)。

图2 miR-142-3p过表达对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的影响

2.5 抑制miR-142-3p表达逆转了蟛蜞菊内酯(40 μmol/L)对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的作用

与感染组+WEL+anti-miR-NC组比较，感染组+WEL+anti-miR-142-3p组miR-142-3p表达水平降低，IL-10水平降低，IL-6水平升高，细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(P<0.05)(图3，表5)。

表4 miR-142-3p过表达对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的影响

分组miR-142-3pIL-10(ng/L)IL-6(ng/mL)凋亡率(%)Bcl-2蛋白Bax蛋白感染组+miR-NC1.00±0.0723.16±2.1966.85±4.0532.31±2.980.21±0.020.57±0.04感染组+miR-142-3p3.15±0.2865.74±4.5331.58±2.8912.67±1.060.61±0.050.27±0.02t22.34825.38821.26718.62822.28320.125P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

图3 抑制miR-142-3p表达逆转了蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡的作用

表5 抑制miR-142-3p表达逆转了蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的作用

3 讨论

肺炎是临床常见呼吸系统疾病，肺炎链球菌是其主要致病病原菌，肺炎链球菌感染可导致肺泡上皮细胞凋亡及分泌炎症因子，进而参与肺部炎症反应[11-12]。本实验用肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞，结果显示，促炎因子IL-6水平升高，细胞凋亡率升高；证明肺炎链球菌可诱导肺泡上皮细胞炎症损伤。研究报道蟛蜞菊内酯可显著减少博莱霉素诱导的炎症细胞浸润，通过激活AMPK可抑制原代肺成纤维细胞的转分化和肺泡上皮细胞的上皮间质转化，进而减轻肺纤维化[13]。蟛蜞菊内酯通过IκK/IκB/NF-κB信号通路减轻了阿霉素诱导的足细胞炎症和氧化应激[14]。本实验用不同浓度蟛蜞菊内酯处理肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞，结果显示，抑炎因子IL-10水平升高，促炎因子IL-6水平降低，细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，且呈浓度依赖性；说明蟛蜞菊内酯可剂量依赖性的抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应，对肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞损伤具有保护作用。

研究报道miR-142-3p通过靶向FBXO3减轻人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的氧葡萄糖剥夺/复氧诱导的损伤[15]。miR-142-3p可降低TNF-α水平和内皮细胞凋亡[16]。miR-142-3p在肺泡上皮细胞和肺成纤维细胞中的过表达能够降低转化生长因子β受体1(TGFβ-R1)和纤维化基因的表达，具有抗纤维化特性[17]。miR-142-3p过表达抑制了缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和纤维化[18]。本实验结果显示，肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞中miR-142-3p表达水平降低；过表达miR-142-3p可降低IL-6水平，提高IL-10水平，降低细胞凋亡率；表明过表达miR-142-3p可抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症反应。此外，蟛蜞菊内酯处理可上调miR-142-3p的表达；抑制miR-142-3p表达逆转了蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的作用。

综上所述，蟛蜞菊内酯可能通过上调miR-142-3p对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤起保护作用。