芦丁联合顺铂抗肺癌作用的初探

买世雄，黄艳智，王振兴，阚元顺，刘珅贺，孙园园，孙 旭，张天行，王 跃*

(1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.长春市儿童医院；3.吉林大学校医院；4.吉林大学药学院)

肺癌(lung cancer)是当前影响人类健康和生命的恶性肿瘤之一[1]。随着生活环境的变化，肺癌的患病率正逐年增加[2]。已有研究发现，我国每年肺癌发病率正以 4.5%的速度上升[3]。目前，肺癌的治疗手段主要是以手术治疗，辅助化疗、放疗、免疫治疗等[4]。而顺铂作为金属铂类络合物，可抑制肿瘤细胞中的DNA复制过程[5]。但肺癌的化疗机理仍有待进一步深入研究。芦丁(Rutin)作为心脑血管类药物，已应用多年[6]。近些年来，芦丁在肿瘤的治疗上也逐渐被报道。本文探讨芦丁联合顺铂对肺癌作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器顺铂(湖北麦凯斯精化科技有限责任公司)；芦丁(四川轩禾康生物科技有限公司)；DAPI(北京百奥莱博科技有限公司)；酶标仪(thermo)；流式细胞仪(常州必达科生物科技有限公司)。

1.2 细胞分组

在实验分为未处理的A549细胞组；2 mg/L顺铂处理A549细胞组；芦丁+顺铂组和顺铂+芦丁组。

1.3 MTT检测细胞活力

进行MTT分析用于研究顺铂+芦丁在肺癌A549细胞中的细胞活力。A549细胞(3×103/孔)在96孔板中培养24 h。随后，每孔加入10 μl MTT溶液(Beyotime Institute of Biotechnology)，细胞在 37℃下培养 4 h。在450 nm处测量光密度(OD) 值。细胞活性=实验组OD值/空白对照组OD值。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期

A549细胞按每孔4×105个密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用顺铂，顺铂+芦丁和芦丁+顺铂药物处理细胞。胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞1次，全部加入15 ml管中。800 rpm离心5 min。用低速振荡器震动边加入5 ml预冷的70%乙醇，固定。次日1 000 rpm的转速离心5 min，弃上清，加入5 μl RNaseA(10 mg/mL)37℃消化1 h，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶(propidium iodide PI)4℃避光染色过夜，在EPICS XL流式细胞仪上分析。

1.5 DAPI检测细胞凋亡

(1)A549细胞每孔0.8×105；(2)移去完全培养基，用PBS清洗1次；(3)4%的多聚甲醛PBS在室温固定20 min；(4)用PBS在室温漂洗3次，每次10 min；(5)用含0.5%Triton-X-100的PBS在室温通透化处理15 min；(6)在室温用含10%NGS的PBS封闭1 h；(7)用含0.1% Tween-20的PBS在室温漂洗3次，每次10 min；(8)去除二抗，加入DAPI染色液室温作用15 min以上；(9)用含0.1% Tween-20的PBS在室温漂洗3次，每次10 min；(10)在荧光显微镜下观察，照相保存实验结果。

2 结果

2.1 MTT检测细胞活力

通过顺铂处理的A549细胞，其细胞活力明显地低于未处理组(P<0.05)；先加顺铂再加芦丁后细胞活力亦明显低于未处理组(P<0.05)；而先加芦丁再加顺铂后A549细胞活力略低于顺铂+芦丁组(P<0.05)，见图1。

图1 MTT测定各组的细胞活力

2.2 流式细胞仪检测细胞周期

顺铂处理的A549细胞，其周期在G2，S期发生明显的变化；在G1期变化不明显；而芦丁+顺铂处理后，除G2，S期变化明显外，A549细胞的G1期亦有所变化。这说明芦丁+顺铂可能对A549细胞的G2、S和G1均具有一定的调控作用(图2)。

图2 芦丁+顺铂对A549细胞周期的影响

2.3 DAPI检测细胞凋亡

顺铂处理后的A549细胞数量较未处理组A549细胞数量明显减少；而芦丁+顺铂处理后，A549细胞数量较顺铂组少；这些结果说明芦丁可增加顺铂的抗肿瘤作用。见图3。

图3 芦丁+顺铂对A549细胞凋亡的影响

3 讨论

目前临床上肺癌的主要治疗手段仍然是手术切除、放射疗法和化学疗法[4]。目前治疗手段对提高肺癌治愈率和生存率十分有限。因此，深入研究肺癌的治疗机理对于提升肺癌的治愈率和生存率具有重要的意义。顺铂作为金属铂类络合物，对肿瘤细胞周期有非特异性，可破坏DNA，抑制肿瘤生长[5]。目前，研究发现顺铂可用于非小细胞肺癌膀胱癌、黑色素瘤、肉瘤、头颈部肿瘤和恶性淋巴瘤的治疗[5]。但在肺癌的治疗机理方面仍有待进一步深入研究。

芦丁作为心脑血管类药物，主要用于脑溢血预防、血管性紫癜症防治、再发性鼻出血、创伤性肺出血和产后流血等[6]。虽然芦丁在肺癌的治疗机理上有一定的研究，但仍有待深入探究。MTT是一种检测细胞存活和生长的方法[7],本实验研究结果显示：通过顺铂处理的A549细胞，其细胞活力明显地低于未处理组，这一结果说明，顺铂可有效地调控肿瘤细胞的活力。而先加顺铂再加芦丁后细胞活力较单独使用顺铂杀伤肿瘤细胞的效果好；而先加芦丁再加顺铂杀伤肿瘤细胞能力更强，但该结果有待更深入的研究。细胞周期概念是构成细胞学说的重要组成部分[8],而大部分化疗药物(如顺铂和柴杉醇)对细胞周期产生特定的作用。细胞周期结果显示：顺铂处理的A549细胞，其周期在G2，S期发生明显的变化；这一结果说明顺铂可调控A549细胞的G2和S期，进而起到化疗的作用。顺铂处理A549细胞后的G1期变化不明显；而芦丁+顺铂处理后，除G2，S期变化明显外，G1期亦有所变化。这说明芦丁可能增强了顺铂对A549细胞G1的调控作用。细胞凋亡受基因调控，它是细胞在主动参与其自身有序的生理性死亡过程[9]。细胞调亡实验结果显示：顺铂处理后的A549细胞数量明显减少；而顺铂+芦丁处理后，A549细胞数量较单独使用顺铂处理后的A549细胞数量少；这一结果说明芦丁可能增强了顺铂对A549细胞的杀伤作用。而先加芦丁后加顺铂较先加顺铂再加芦丁的杀伤效果更佳。但该结果仍有待进一步论证。