人参皂苷诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡和自噬

秦 瑞，纳 钦，曹 璐，刘俊宝，边 帅，冷维春*

(1．吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033；2．内蒙古科尔沁右翼中旗蒙医医院,内蒙古 兴安盟029400；3.科尔沁右翼中旗蒙医研究所,内蒙古 兴安盟029400；4.长春中医药大学·吉林省人参科学研究院，吉林 长春130117)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，早期患者可以通过手术切除病灶获得根治或延缓疾病的发展，晚期患者最常规的治疗手段就是放疗与化疗[1-4]。然而，放化疗对于一部分的晚期患者疗效有限[5]。流行病学研究已充分明确，生殖器感染HPV与宫颈癌的发生和性行为存在联系。若个人任一阶段曾存在多个性伴侣，或性伴侣较多人员的伴侣，则感染 HPV 的风险更大[6-7]。自噬与一些生物功能和其他应激反应的整合是由承担调节机制的转录因素决定的[8]。人参所含人参单体皂苷的种类在40种以上，提取自人参根内的单体皂苷成分以Rb1、Rc等为主，在削弱肿瘤生长，减弱肿瘤细胞侵袭性以及加速肿瘤细胞凋亡等方面，Rh2和Rg3发挥着关键作用[9-12]。本研究探讨人参皂苷(Ginsenoside)影响宫颈癌HeLa细胞自噬与凋亡状况，报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

复苏人类宫颈癌HeLa细胞(ATCC，CCL-2),待已融化，马上添加适量(基本为等量)的DMEM[由10%FBS(胎牛血清)与青/链霉素(1%)制备]内，先离心，再取出，将上清倒掉，添加适量的DMEM，再次反复吹打，然后全部转移至已提前加入5 ml DMEM的T25细胞瓶中，将细胞瓶(内含HeLa细胞)移至温度、湿度皆恒定的培养箱内培养。倒置显微镜下观察，待瓶底细胞80%左右，开始传代与铺板。

1.2 主要仪器与试剂

1.3 CCK-8 法检测细胞存活率

将 HeLa 细胞用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两次，向96孔板内接种细胞，各孔的接种量皆为2×103，第2 d，待细胞贴壁，将上清培养液清除掉，再添加培养基，完成DMSO对照组、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3实验组的设置，这2组皆设置4个复孔，各孔体积皆为0.2 ml，经过1 d培养，向各孔添加CCK-8 试剂，加量皆为0.02 ml，再移至培养箱(37 ℃)内，进行45 min遮光孵育，借助酶标仪，测定各孔OD 450 nm值，同时对每组细胞存活率进行计算。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

1.5 蛋白质印迹分析

通过离心收集处理的细胞，重悬于裂解缓冲液中，煮沸15 min。用Bradford测定试剂盒测定总蛋白浓度。然后通过12%SDS-PAGE(每泳道8 μg)分离蛋白质，然后将其转移到硝酸纤维素膜上。于室温环境中，把膜浸于干脱脂牛奶(5%)内，接受0.5 h的封闭处理。再通过PBST(PBS tween-20)实施洗涤，之后对膜和一抗(1∶1 000)于4℃温度下实施12 h的孵育处理，再和二抗(1∶1 000)于室温中实施60 min的孵育处理。 最后，通过化学发光底物将蛋白质信号可视化，并使用Ibright成像系统进行成像，使用ImageJ软件进行光密度分析。

1.6 吖啶橙(AO)染色法

向12孔板内接种细胞，同时培养12 h，之后分别添加DMSO、Rh2、Rg3接着进行1 d培养。通过PBS对细胞实施1遍洗涤处理，于室温环境中，通过甲醛(4%)固定，计时10 min，通过PBS对细胞实施洗涤，添加AO染色液(0.01 mg/mL)，再进行20 min的遮光孵育处理。然后用AO在黑暗中染色30 min，在488 nm的荧光显微镜下观察并成像。

1.7 统计学处理

全部数据为3次平行实验结果，且由“平均值±标准差”描述。统计学方法采用Repeated Measures ANOVA法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷影响宫颈癌HeLa细胞增殖状况

如图1所示(显示部分皂苷)，在正常培养条件下，作用时间24 h，HeLa细胞Rb1、Rh2和Rg3的细胞毒性筛选发现，人参皂苷Rh2在浓度为45 μM和Rg3浓度为75 μM时，细胞活力显著下降。

图1 人参皂苷对宫颈癌细胞增殖的影响

2.2 人参皂苷对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组相比较，宫颈癌HeLa细胞经过Rh2和Rg3处理后的凋亡率分别为32.07%和27.13%，都显著高于DMSO组的2.08%。经由蛋白免疫印迹可知，对宫颈癌HeLa细胞完成Rh2、Rg3干预，细胞内Bax凋亡相关蛋白含量大幅增多，Bcl-2凋亡相关蛋白含量则大幅减少。

图2 人参皂苷促进宫颈癌HeLa细胞凋亡及相关凋亡蛋白的表达

2.3 人参皂苷影响宫颈癌HeLa细胞自噬状况

在人参皂苷处理后，许多AVOs以剂量依赖性方式出现。也就是当自噬水平较低时，主要观察到绿色荧光，当自噬水平升高，则绿色荧光减弱，红色荧光增强。如图3所示，结果表明，人参皂苷Rh2和Rg3都能显著提高宫颈癌细胞的自噬水平。

图3 人参皂苷对宫颈癌HeLa细胞自噬的影响

3 讨论

自噬抑制属于一类具创新性的细胞调控机制，自噬同肿瘤发展存在紧密联系，对确定肿瘤新的治疗靶点和寻找新的抗肿瘤药物具有重要意义。中药可否经由调控肿瘤细胞的自噬途径，实现对肿瘤的有效抑制效果，为今后抗肿瘤研究的趋势。

对于包括子宫颈癌在内的多种癌症，介入治疗是一种副作用少、并发症少的新疗法。人参皂苷在癌症[13-15]的预防和治疗中发挥着重要作用。可通过介入治疗与其他化疗药物联合使用，避免口腔和肠道的降解。与口服相比，局部应用可减少化疗药的用量[16-17]。

本研究通过筛选多种人参皂苷，证实Rh2以及Rg3皆可以显著削弱宫颈癌细胞的增殖，使细胞活力降低，并且促进细胞凋亡，同时提高了宫颈癌细胞的凋亡蛋白表达水平。总之，Rh2与Rg3这两种人参皂苷可对细胞增殖施以有效抑制，对其凋亡进行促进，期间可将细胞自噬激活。而人参皂苷对宫颈癌细胞的凋亡同自噬间的联系与确切机制依然有待开展深入的研究和探索。