Leptin转染人胎盘间充质干细胞对辐照后口腔黏膜修复细胞的作用及机制分析

杨 雨，刘定坤，李凌峰，隋 欣，王碧舟，刘志辉

(吉林大学口腔医院，吉林 长春130021)

口腔癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一，术后放疗为减少复发的主要手段，患者在放疗时除了杀伤肿瘤细胞外，对周围组织也有不同程度的损伤[1]。大量临床报告显示，恶性肿瘤术后并行放疗的患者通常会出现放射损伤复合皮肤损伤，是一种典型的“放创复合伤”(Combined radiation and wound injury,CRWI)[2]，这类创口迁延难愈。以往有研究[2-3]报道干细胞疗法可以改善辐射损伤对皮肤组织的不良影响，促进组织愈合。瘦素(Leptin)是一种多效的细胞因子，近年来的研究[4-5]显示，Leptin在伤口愈合中也发挥着重要的作用。研究发现[6]，表达外源性Leptin基因的HPMSCs能显著提高CRWI皮瓣的成活率，提示干细胞疗法结合基因疗法在CRWI伤口愈合中具有的潜在的研究及应用价值，但转染Leptin的HPMSCs对放射后皮肤或粘膜修复细胞的作用尚不明确。本研究基于本课题组之前的研究结果，通过建立口腔牙龈黏膜修复细胞放创复合伤体外模型，进一步研究HPMSCs/Leptin对牙龈黏膜修复细胞的趋化能力、增殖能力以及炎症因子分泌水平的影响，为后续实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和设备人口腔角质细胞HOK 2610、人牙龈成纤维细胞HGnF 2620和人脐静脉内皮细胞HUVEC 8000(广州基尼欧生物科技有限公司)，转染空白慢病毒载体的人胎盘源间充质干细胞HPMSCs/NC和转染Leptin慢病毒载体的人胎盘源间充质干细胞HPMSCs/Leptin由本课题组前期实验留存，DMEM(Gibco，12800-017)，血清、胰酶(Gibco，25200-056)，Transwell侵袭小室(BD Biocoat，354480)，ELISA试剂盒：Human GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA KIT(欣博盛，EHC103a)，CKK-8试剂盒(碧云天，C0042)，二氧化碳培养箱(Thermo，3111)，激光共聚焦显微镜(NIKON，C2)，辐照仪(Faxitron，MultiRad225)，研究级倒置显微镜(mshOt，MF51)，酶标仪(BioTek，ELX800)。

1.2 方法

1.2.1实验分组 实验随机分为HPMSCs/NC组[对照组，L.v.-pEB-copGFP(T2A) PURO]和HPMSCs/leptin组[实验组，L.v.-pEB-copGFP(T2A) PURO-leptin]，HPMSCs/NC和HPMSCs/leptin均培养于含10%血清、1%双抗的DMEM-LG培养基中，置于CO2孵箱中培养(培养条件为5%CO2、饱和湿度、37℃)。

1.2.2辐照处理与Transwell检测 复苏HOK、HGnF和HUVEC细胞加入到含10%血清、1%双抗的DMEM-LG培养基中，置于CO2孵箱中培养。当细胞融合度均达到90%时，进行单次X射线辐射，剂量20GY。选择8.0 μm PET膜的Transwell系统，使用无血清的DMEM重悬辐照后的HOK、HGnF和HUVEC，各取100 μl(约含细胞1×105个)加入Transwell的小室上室，在下室加入1×104个HPMSCs/NC或HPMSCs/leptin细胞，孵育48 h后弃去上室细胞，4%多聚甲醛固定膜下表面的细胞，结晶紫染色，倒置荧光显微镜下观察拍照，随机选择图片并计数。

1.2.3构建共培养体系 选择0.4 μm PET膜的Transwell系统，取辐照后的HOK、HGnF和HUVEC细胞悬液400 μl(含细胞1×105个)分别加入上室，下室加入HPMSCs/Leptin或HPMSCs/NC各200 μl(含细胞1×104个)，置于CO2孵箱中培养。构建6组共培养体系即实验组：HGnF+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/Leptin、HUVEC+HPMSCs/Leptin；对照组：HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/NC、HUVEC+ HPMSCs/NC。

1.2.4细胞增殖活性检测 于1、2、3、4 d分别收集上述6组共培养体系中辐照后的HOK、HGnF和HUVEC细胞，调整细胞密度为2.0×104个/ml，按100 μl/孔(即2.0×103个细胞)接种于96孔板，置于CO2孵箱中培养24 h。每孔加入10 μl CCK-8检测液，置于孵箱培养2 h，使用酶标仪测定450 nm处的光密度值即OD450。

1.2.5ELISA检测 收集各组(HGnF+HPMSCs/Leptin、HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/Leptin、HUVEC+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/NC、HUVEC+HPMSCs/NC)培养基，使用合适的ELISA试剂盒检测人GM-CSF、IL-1、IL-6和IL-8，使用酶标仪测定OD450值。所有ELISA检测均严格按照各试剂盒说明书进行。

1.2.6统计学分析 采用IBM SPSS Statistics 22进行数据分析，GraphPad Prism 7数据以均数±标准差(SD)表示。各组采用单因素方差分析，并辅以Bonferroni校正。实验组与对照组间比较使用t检验，以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Transwell检测结果

HPMSCs/NC和HPMSCs/Leptin对辐照后的HGnF、HOK和HUVEC均有不同程度的趋化性(如图1)，相比于HPMSCs/NC组，将HPMSCs/Leptin组置于Transwell模型下室时，能使更多的HUVEC迁移到下室，表明HPMSCs/Leptin能促进HUVEC的迁移，推测HPMSCs/Leptin对HUVEC的趋向性增强；但相比于HPMSCs/Leptin组，将HPMSCs/NC组置于Transwell模型下室时，能使更多的HGnF和HOK迁移到下室，表明HPMSCs/Leptin抑制HGnF和HOK的迁移，推测HPMSCs/Leptin对HGnF和HOK的趋向性减弱。

图1 Transwell检测结果

左图为各混合培养体系中HPMSCs/NC或HPMSCs/Leptin诱导进入下室的辐照后的HGnF、HOK和HPMSCs细胞结晶紫染色结果。右图为进入下室的细胞数(*：0.01

2.2 细胞活性的CCK-8检测结果

如图2A所示， HGnF+HPMSCs/Leptin混合培养体系的OD450值与HGnF+HPMSCs/NC混合培养体系的OD450值无显著性差异(P>0.05)，表明HPMSCs/Leptin对辐照损伤后的HGnF的增殖能力影响不大。图2B显示，HOK+HPMSCs/Leptin混合培养体系的OD450值显著高于HOK+HPMSCs/NC混合培养体系的OD450值(0.001

图2 各混合培养体系中辐照后的HGnF、HOK和HUVEC细胞增殖活性CCK -8检测结果

2.3 ELISA检测结果

如图3所示，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定辐照损伤后24 h、48 h和72 h各混合培养体系中分泌的炎性细胞因子浓度。与对照混合培养体系(HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/NC)相比，实验混合培养体系(HGnF+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/Leptin、)培养基上清液中人IL-1α、GM-CSF和TNF-α在各时间段(辐照后24 h、48 h和72 h)的分泌量显著高于对照混合培养体系(P<0.05)。在辐照损伤后72 h，检测各混合培养体系培养基上清液中人IL-6的分泌量，HOK+HPMSCs/NC和HOK+HPMSCs/Leptin间无显著性差异(P>0.05)，混合培养体系HGnF+HPMSCs/Leptin显著高于其对照混合培养体系HGnF+HPMSCs/NC(P<0.001)。

图3 ELISA检测各混合培养体系中辐照后的HGnF、HOK和HUVEC表达炎性因子(IL-1α、IL-6、GM-CSF、TNF-α)水平

此外，各混合培养体系中人IL-1β和IL-8的分泌量太少而未能检测出。综上，实验结果表明，HPMSCs/Leptin能促进HGnF、HOK分泌炎症因子人IL-1α、IL-6、GM-CSF和TNF-α。

3 讨论

口腔牙龈黏膜的主要修复细胞包括角质细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞。辐照损伤后，伤口修复细胞数量减少或功能障碍导致生长因子和胶原合成减少[7]，伤口局部的血管在受到放射损伤后也会因管壁水肿而发生血管阻滞和封闭[8]，导致伤口局部细胞因子缺乏和相关细胞趋化障碍。这些生理现象都阻碍了伤口的正常愈合过程，造成了伤口的迁延不愈。

本研究通过建立口腔牙龈黏膜修复细胞放创复合伤体外模型，结果证实表达外源性Leptin的人胎盘源间充质干细胞HPMSCs/Leptin能明显促进HUVEC迁移，从而招募更多HUVEC到达伤口床及伤口边缘以促进血管形成，进而促进伤口愈合。本实验还发现相比于对照组，HPMSCs/Leptin组对辐照后HGnF或HOK细胞趋向性减弱，而Tadokoro等[5]的研究则认为，局部注射Leptin后，其可促进表皮角质形成细胞的增殖、分化和迁移从而促进皮肤伤口愈合，这与本实验结果相悖，原因可能是由于细胞种类不同，或与口腔黏膜角质细胞的特性有关，然而目前尚无有利证据解释这一差异，希望在今后的研究中进一步探讨。此外，本实验发现转染空白慢病毒载体的人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs/NC组)对辐照损伤后的3种口腔牙龈黏膜修复细胞均有一定的趋向性，证实HPMSCs本身也能在一定程度上促进口腔牙龈黏膜修复细胞的迁移。

辐照损伤后修复细胞数量的减少可能是由于细胞凋亡增加或细胞增殖受抑，亦或是两者共同作用的结果。李培兵等[9]发现，Leptin可促进大鼠成纤维细胞的增殖。也有研究[5]认为Leptin可促进伤口处角质细胞和血管内皮细胞的增殖能力，为角质细胞覆盖创面和内皮细胞成血管化奠定物质基础，进而促进伤口愈合。本研究建立了HPMSCs/Leptin与3种口腔牙龈黏膜修复细胞混合培养体系，CCK-8结果显示，HPMSCs/Leptin能促进辐照损伤后的HUVEC和HOK的增殖，而对辐照后HGnF的增殖能力未见显著增强。这一结果与李培兵等[9]研究结果不同，差异可能与成纤维细胞的种属不同有关，该问题将在今后的研究中进一步探讨。

相较于一般伤口，放创复合伤伤口难愈合的原因之一就是伤口局部的血管在受到放射损伤后会因管壁水肿而发生阻滞和封闭[8]，导致到达伤口局部的细胞因子缺乏。细胞因子是一类小分子活性多肽，对细胞的生长、分化具有显著的调控作用，并在细胞趋化、细胞增殖、血管新生、胶原合成和基质成熟等伤口愈合过程中发挥着重要的作用。白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)在宿主抵御感染、炎症、损伤和应激等方面发挥着关键作用[10]。IL-1包括白细胞介素-1α(IL-1α)和白细胞介素-1β(IL-1β)两种亚型，其在角质细胞、成纤维细胞和内皮细胞中均有表达。IL-1α能与IL-1R结合并激活细胞[11]。IL-1β是一种可诱导的细胞因子，在正常细胞或组织中不表达，受到刺激后才表达。Lierova1等[12]研究发现，电离辐射损伤肺上皮后可导致IL-1α从应激和/或坏死的细胞中释放到达细胞外间隙。本研究发现，HPMSCs/Leptin能促进HGnF、HOK和HUVEC分泌炎症因子人IL-1α，而对人IL-1β的分泌无明显影响，推测HPMSCs/Leptin促进辐照损伤后的修复细胞分泌更多的IL-1α，促进炎症反应，而IL-1β相对低水平的分泌量调控了炎症反应的进程，防止过度炎症反应对机体的损伤，可能是一种保护性机制。

白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一种多功能的多效细胞因子[13]，在伤口愈合中主要起促进炎症反应的作用。放射性肺炎患者血液标本中IL-6水平显著升高，IL-1α水平的增高与IL-6呈正相关关系[14]。本研究发现，HPMSCs/Leptin能促进HGnF、HOK和HUVEC分泌炎症因子人IL-6，推测HPMSCs/Leptin可促进辐照损伤后的修复细胞分泌更多的IL-6，协同增加的IL-1α水平，促进炎症反应。

白细胞介素-8(IL-8)，又称趋化因子-8(CXCL-8)，其不仅是一种炎症介质，还作为一种趋化因子，可吸引血管中的炎细胞(尤其中性粒细胞)到达局部组织参与炎症反应。此外，IL-8可诱导内皮细胞的迁移，使具有血管生成活性[12]，还可通过引起局灶性粘附的丧失而趋化成纤维细胞。本研究发现，各组辐照后细胞的IL-8表达水平低下，表明HPMSCs/Leptin在伤口愈合过程中的作用可能与IL-8无关。

粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)属于糖蛋白分子家族，具有多重生物活性。有研究文献报道[15]在伤口愈合的组织增殖期，GM-CSF能促进内皮细胞、成纤维细胞和角质细胞的趋化、增殖和分化，加速血管新生、促进肉芽组织形成、创面收缩[16]和再上皮化，从而发挥促进伤口愈合作用。本研究发现，HPMSCs/Leptin组3种辐照后细胞GM-CSF的表达水平均被上调，认为HPMSCs/Leptin有利于GM-CSF的表达进而发挥促进伤口愈合的作用。

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种由单核-巨噬细胞分泌的促炎细胞因子，能局限组织损害和促进创伤组织的修复与改建[17]。本研究发现，HPMSCs/Leptin组可提高辐照后HGnF、HOK和HUVEC 3种细胞表达TNF-α的水平，认为HPMSCs/Leptin可通过促进TNF-α的表达对伤口愈合起到积极作用。

此外，本课题组前期实验表明[6]，在放创复合伤大鼠模型中，转染Leptin的HPMSCs能增加皮瓣内皮细胞特异性因子的表达和新生血管的数量，促进放创复合伤皮瓣的愈合。

综上， HPMSCs/Leptin对辐照后HGnF、HOK和HUVEC这3种口腔牙龈黏膜修复细胞的迁移、增殖、表达炎症因子水平均有不同程度的影响，猜测HPMSCs/Leptin可通过补充修复细胞、调节炎症反应、促进血管新生等途径发挥促进伤口愈合的作用，然而，其内在相互作用机制仍有待进一步探索和验证。此外，在放创复合伤愈合过程中，转染Leptin的HPMSCs与口腔牙龈黏膜修复细胞之间其它可能的相互作用、作用途径和机制仍有待进一步探索。