miRNA-612表达水平对宫颈癌细胞增殖的影响

廉 静，张露文，陈勃同

(1.哈尔滨医科大学附属第四医院 医务科，黑龙江 哈尔滨150001；2.澳门科技大学；3.东北农业大学)

宫颈癌是常见的妇科肿瘤之一，尽管手术、放疗、化疗和放化疗联合等先进治疗手段提高了总体生存率，但是因为耐药和复发等因素，晚期或者发生远处转移的宫颈癌病人预后较差，5年生存率较低[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小的(长度为19-25个核苷酸)不具有编码功能的非编码RNA分子，通过结合靶基因的mRNA的3′-UTR(非编码区)来参与基因表达及功能的调控[2]。国内外研究表明，miRNA在多种生物学过程中发挥不可替代的调节作用，例如发育、DNA损伤修复和分化、细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等。此外，miRNA失调与癌症和其他人类疾病的发生有关，其作为癌基因或肿瘤抑制因子参与各种癌症(包括宫颈癌)的病理生理过程[3]。本实验分别检测了3种不同类型宫颈组织中miR-612的水平，并研究了HeLa 细胞中miR-612表达变化时相应的细胞增殖率变化趋势，以期加深对miR-612在宫颈癌中的认识。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

HeLa(人宫颈癌细胞)购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司；miRNA-612 mimics(miRNA-612模拟物)以及与其匹配的阴性对照(NC)购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司 ； DMEM培养基购自美国 Gibco 公司；胰酶细胞消化液(0.25%胰酶)和Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自四季青生物科技有限公司；Trizol 购自美国Invitrogen 公司 ；将总RNA逆转录成cDNA所用的试剂盒购自上海东洋纺(TOYOBO)生物科技有限公司；SYBR Green试剂盒购自美国Roche公司；RT-PCR实验中涉及到的U6和miR-612 mRNA的引物序列均由北京睿博兴科生物技术有限公司设计并合成。

1.2 组织标本

选取并收集130例2019年1月—2021年3月就诊于哈尔滨医科大学附属第四医院的宫颈癌患者经手术切除的宫颈癌组织以及癌旁组织。收集120例经病理学检测正常的宫颈组织。所有患者平均年龄50.62±6.29岁，排除术前接受放疗、化疗或其他接受抗癌治疗的患者。收集的所有组织标本均于手术取出后立即保存在液氮中，并转移至-80℃冰箱保存，待进一步检测。本研究经过医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.3 细胞培养和转染

在37℃、5%二氧化碳浓度的环境中，用DMEM 培养基培养 HeLa 细胞，DMEM中添加10%的优质胎牛血清以及青霉素-链霉素溶液。应用 Lipofectamine法将miR-NC和miRNA-612 mimics 转染到miR-NC组和miR-612 mimics组细胞中，仅添加转染试剂组为正常对照组。转染6 h后，将细胞消化每组设5个复孔，培养48 h 后，方可进行接下来的相关检测。

1.4 RT- PCR 检测 miRNA-612 mRNA 表达

取不同组织标本和3组HeLa细胞，用TRIzol法提取总RNA，并检测RNA 浓度和纯度，根据逆转录试剂盒说明，将提取的总RNA 逆转录成cDNA,根据SYBR Green 试剂说明书，制备 10 μl反应体系进行扩增。U6作为内参对照， miRNA-612 mRNA的相对表达水平采用 2-△△Ct法进行计算。

1.5 CCK-8 法检测细胞增殖情况

待转染完成后，收集并用DMEM重悬细胞，分别将3组细胞悬液接种于96孔板中，每组设置5个复孔，每孔加入100 μl DMEM，含有细胞数量为5×103个，在第0 h、12 h、24 h、 36 h和48 h分别向相应的培养孔中加入CCK-8试剂10 μl，37℃条件继续孵育3.5 h,酶标仪测定630 nm 处相应的吸光值，计算细胞增殖率。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 miRNA-612在3种组织中的表达

宫颈癌组织中miRNA-612的相对表达低于正常宫颈组织和宫颈癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05) ，提示miRNA-612 在宫颈癌组织中低表达；正常宫颈组织和宫颈癌旁组织中miRNA-612的相对表达水平无明显差异(P>0.05)。 见表1。

表1 组织标本中miRNA-612的表达水平

2.2 miRNA-612在3组细胞中的表达

miR-612 mimics组中的miRNA-612的相对表达水平明显高于其在正常对照组和 miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示转染成功，且miRNA-612在细胞中成功高表达；miRNA-612在正常对照组和 miR-NC组中的表达水平相近，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 miRNA-612在3组细胞中的表达水平

2.3 3组细胞的增殖情况

与正常对照组和 miR-NC组相比，miR-612 mimics组细胞增殖率减低，差异明显，具有统计学意义(P<0.05)，即在HeLa 细胞中过表达miR-612后，可以抑制HeLa 细胞的增殖；而正常对照组和 miR-NC组细胞增殖率相比，差异不明显(P>0.05)。见表3。

表3 3组细胞的增殖率(%)

3 讨论

大量研究发现，miRNA是多种疾病发病机制的关键调节者，也是一类有前景的治疗靶点[4]。随着多种miRNA被发现，癌症的分子机制和诊疗策略得到了更深入的发掘，其在癌症中的作用越来越受到关注[5]。

近年来，宫颈癌的发病率和死亡率均呈现显著下降趋势，但是在一些发展中国家还是持续在较高水平[6]。因此，完善宫颈癌的发病机制，探寻与诊断、治疗和预后相关的生物学标志物已成为研究工作的重点。有证据表明，宫颈癌组织中许多miRNA的表达发生变化，在宫颈癌的发生、发展和转移中发挥着至关重要的作用[7]。进一步探究miRNA在宫颈癌中的调控功能及其可能的分子机制可能有助于确定诊断标志物和治疗靶点。有研究显示，MiR-612在肝癌中负调控肝癌侵袭性瘤体形成、基质降解、上皮间质转化和转移[8]，此外，MiR-612在子宫内膜癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、胃癌、黑色素瘤中也被不同程度的下调，暗示其发挥潜在的抑制肿瘤的作用[9]。但是，miR-612在宫颈癌中的表达情况以及发挥的相关作用还没有确切的报道。

本研究分别检测了3种不同宫颈类型组织中miR-612的水平并进行比较，确定了miR-612与宫颈癌相关。此外，培养HeLa细胞，并通过转染使miR-612在细胞中过表达，与未经处理的HeLa细胞以及转染对照的HeLa细胞进行比较。组织标本检测结果表明，与正常宫颈组织和宫颈癌旁组织相比，miR-612在宫颈癌组织中呈现出低表达趋势。体外功能实验表明，过表达miR-612后的HeLa细胞与未经处理的HeLa细胞以及转染对照的HeLa细胞相比增殖率明显减低，说明miR-612可抑制HeLa细胞的增殖。

综上，miR-612在宫颈癌中表达减低， miR-612在体外抑制宫颈癌细胞增殖，这表明miR-612可能对宫颈癌具有抗癌作用，很有可能在未来的宫颈癌诊断、治疗管理中发挥重要作用，然而其明确的临床意义还需要进行大量研究加以论证。