高灵敏电化学发光法检测人血清中FT4方法的建立

席 杰，梁 辰，邓子辉，冯 杰，薛 辉，师丹丹，高艳红，颜光涛*

电化学发光免疫分析是一种先进的免疫检测方法，其结合了免疫检测和电化学发光技术[1]，具有灵敏度高，特异性强，稳定性好，反应速度快，标本用量少等特点[2-3]。电化学发光免疫分析因自动化程度高、线性范围广等特点在临床应用广泛，其主要用于病毒、激素和肿瘤标记物的检测等，可以快速准确的检测临床标本，为疾病的筛查和鉴定提供依据。FT4能够准确地反应甲状腺的功能，其在甲亢、甲减等发病的过程中都起到重要的作用,是甲状腺功能一个灵敏的指标[4]。本文采用竞争法一步法的原理检测人血清中FT4浓度，将样本和生物素标记的FT4抗原，竞争性结合三联吡啶钌标记的抗体，形成的免疫复合物与链霉亲和素包裹的磁珠形抗原抗体复合物，通过磁场洗涤将未结合物冲洗除去，从而检测出待测样品中的FT4浓度。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和材料

1.1.1主要仪器 cobas e601全自动电化学分析仪：Roche Diagnostics GmbH；eCL 8000全自动化学发光测定仪：深圳普门公司。

1.1.2主要试剂 FT4抗体、生物素化的FT4均购于深圳君领生物科技有限公司；自Sigma公司采购生物素；自上海海肽生物科技有限公司采购抗原；自Thermo Fisher采购链霉亲和素磁颗粒；由深圳普门公司合成三联吡啶钌；由Equitech-Bio公司提供牛血清白蛋白(BSA)；其他的试剂均为分析纯。

1.1.3标本来源 分别收集解放军总医院第一医学中心的294例健康体检者的血清和 72例甲功异常患者的血清。健康体检患者入选标准：①血液指标正常:血、尿常规及生化肿瘤项目等指标正常;②无高血压、糖尿病、心脑血管疾病等重大疾病;③近期无输血和手术史。健康体检患者血清样本排除标准：①溶血标本;②黄疸样本;③乳糜标本;④标本放置时间过久。

1.2 操作方法的建立

1.2.1质控品和校准品的制备 用牛血清白蛋白和Buffer(含有0.05% Proclin300，经0.22 μm的滤膜过滤)稀释FT4抗原(上海海肽生物科技有限公司)纯品，并且放在2-8℃长期保存。校准品可溯源到Roche Elecsys FT4。

1.2.2磁珠的制备 将链霉亲和素包被的磁珠用PBS稀释，调整浓度到0.75 mg/mL，放于2-8℃避光保存。

1.2.3标记抗体的制备 加入一定体积的25 mM EPPS(pH7.4)将FT4单克隆抗体调整为1.0 μg/ml的浓度；该抗体与三联吡啶钌和生物素分别按1∶20和1∶10 mol比例混合，在CB(0.05 M、 pH9.5)环境下，于室温反应0.5-1.5 h；经过3次透析纯化后，可除去未交联的小分子样物质；随即加等体积的甘油，放在2-8℃保存。

1.2.4实验方法 本方法采用竞争法一步法模式进行检测，将样本和生物素标记FT4抗原竞争性结合三联吡啶钌标记的抗体，37℃孵育9 min后，形成了抗体-抗原复合体。该复合物与链霉亲和素包被的磁微粒通过生物素，37℃孵育9 min，形成链霉亲和素磁颗粒-生物素抗原-钌抗体复合物，经过磁场的洗涤，可以将未结合的物质冲洗除去；随即在三丙胺激发缓冲液的环境下，检测RLU。根据标准品的相对光子强度绘制标准曲线，而后检测出待测标本中的FT4含量。

1.2.5试剂盒优化 根据反应体系如何选择标本的加样量、抗原基质、反应体系稀释液和抗体工作液浓度以对反应体系来进行优化。

1.3 方法学评价

1.3.1灵敏度 将校准品基质(马血清)重复测定20次，计算出RLU的平均值(M)和标准差(s)，可以得出M-2s。将 M-2s所对应的相对光强代入定标曲线中，求出对应的浓度值，即灵敏度。

1.3.2准确度 测定不同浓度FT4添加物样本，其准确度应在90%-110%之间。

1.3.3精密度 a批内精密度：分别重复检测20次以下浓度水平的样本：(18±3)pmol/L和(37±5)pmol/L，并算出测量结果的M和s。变异系数(CV)即s与M之比。b批间精密度:分别用3个批号的试剂检测以下浓度水平的样本：(18±3)pmol/L和(37±5)pmol/L，每个试剂盒重复检测10次，算出30次测量结果的M和s并计算CV。

1.3.4线性 将线性范围上限和下限附近的样本进行混合，分别按以下比例(1∶0、1∶0.25、1∶1、0.25∶1、0∶1)稀释成5种不同的浓度，并分别重复测定3次，计算各个样本的平均值，同时根据稀释比例算出各个样本的理论值，将得出的理论值和实测值回归分析，得出相关系数r。

1.3.5热稳定性 将试剂盒在37℃分别放于0、2、4、6、8天后，和放于4℃的试剂盒比较，进行性能评估。

1.3.6方法学比对 同时使用本方法的试剂盒和罗氏公司的FT4检测试剂盒(电化学发光法)，分别测定44例血清中的FT4浓度，从而算出相关系数。

1.3.7参考范围建立 通过检测294例(男性150例，女性144例)健康人群的血清标本，检测指标为血清FT4,计算出血清FT4均值和标准差，从而得出样本95%参考范围。

2 结果

2.1 校准品和质控品的浓度

低值和高值的校准品浓度分别为：(10±1) pmol/L、(42.5±2.5) pmol/L。低值和高值的质控品浓度分别为(25±4) pmol/L、(50±5) pmol/L。

2.2 试剂盒的优化

2.2.1选择标本加样量

分别取10、15、30、45、60 μl的标本进行加样，并且检测C0及C1水平，根据信噪比数值，选择了样本用量为15 μl(图1)。

图1 标本用量与信噪比的关系

2.2.2选择抗原基质

分别筛选马血清、新生牛血清、PBS-BSA(牛血清白蛋白+Buffer)、小牛血清、山羊血清等几种常见抗原稀释液。根据测定到的C0和C1时的信噪比与发光值水平，将牛血清白蛋白+Buffer作为FT4的抗原稀释液。

2.2.3选择反应体系稀释液

分别筛选多种不同pH值的缓冲液：0.1M PBS缓冲液(pH=6.4、7.4、8.4)、25 mM MES缓冲液(pH=6.0)、25 mM EPPS缓冲液(pH=7.4)等。根据检测到的C0和C1时的信噪比与发光值水平，决定0.1M pH7.4的PBS缓冲液为最终选择的缓冲液。

2.2.4选择抗体工作液浓度

将生物素标记抗体配制工作浓度分别为0.5、1.0、1.5 ng/mL、和三联吡啶钌标记抗体的工作浓度分别是75 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL，采用正交实验，根据信噪比比值，选择生物素和三联吡啶钌标记抗体的工作浓度分别为：1.0 ng/mL和100 ng/mL。

2.3 方法学评价

2.3.1灵敏度灵敏度为不大于0.30 pmol/L。

2.3.2准确度

测定不同浓度FT4添加物样本，其准确度应在90%-110%之间。

2.3.3精密度

该方法的批内变异小于10%，批间变异小于15%(表1)。

表1 标本批内变异和批间变异的结果

2.3.4线性

在0.30-100 pmol/L范围内，相关系数(r)高于0.9900，由此说明在此范围内相关性良好(图2)。

图2 FT4线性

2.3.5热稳定性

将试剂在37℃分别放置0、2、4、6、8天后，检测各项性能指标，结果显示检测结果均达标(表2)。

表2 热稳定性检测结果

2.3.6方法学比对

将44例血清标本中的FT4浓度分别用罗氏公司和本方法中的FT4检测试剂盒测定，其相关方程为Y=1.0039X-0.7512，相关系数为r=0.9899，见图3。根据偏倚图得知，测定值之间的差异呈随机化，见图4。

图3 FT4标本比对相关性

图4 FT4标本比对偏倚图(相对)

2.3.7正常参考范围的建立

通过检测294例(男性150例，女性144例)健康人群血清标本，得出的参考范围为：10.51-22.7 pmol/L。

3 讨论

甲状腺疾病是一种常见的内分泌疾病，而甲状腺激素水平的变化在甲状腺疾病的诊断与治疗中发挥了重要作用。FT4是一种游离甲状腺激素，其能通过透过血管屏障与靶细胞结合从而发挥作用。患有甲状腺中毒症[5]、突眼性甲状腺功能亢进症[6]、无痛性甲状腺炎伴甲亢[7]、亚急性甲状腺炎伴甲亢[8]、甲状腺激素不应症[9]的患者多表现为游离甲状腺素(FT4)的升高；患有甲状腺功能减退(原发性)[10]和低白蛋白血症患者[11]多表现为游离甲状腺素(FT4)的降低。FT4可以作为区分甲亢，甲减及甲功的亚临床状态，是一种反应甲状腺功能的灵敏指标。随着现代医学的进步，有研究发现，甲状腺激素水平不仅能够反应甲状腺相关疾病，其与糖尿病[12]的发生、妊娠妇女胎儿的健康[13]、产后抑郁[14]等有相关性。研究表明，甲状腺功能的改变与糖尿病的发生相关，即使FT4指标在正常范围内，高水平的 FT4 与降低糖尿病的发生仍然相关[12]。妊娠妇女合并TSH降低、FT4升高，表现为妊娠期甲亢，甲亢妇女代谢相对旺盛，此时胎儿能量相对不足，因此，新生儿容易出现颅骨发育不全，呼吸困难、心衰等症状，因此妊娠期检测FT4指标对于新生儿的健康具有重要意义[13]。有研究表明，妊娠妇女产前低浓度水平的FT4与产后 18周内出现产后抑郁相关[14]，妊娠妇女产后第4天低浓度水平的FT4与产后第1周抑郁的发生有关[15]。

电化学发光免疫分析技术在我国临床医学方面得到了广泛的应用，主要用于监测疾病方面，是一种标记性免疫分析技术[16],电化学发光免疫分析技术具有高稳定性、高灵敏度、检测准确、无毒无害等优势[17]。电化学发光免疫分析技术对于微量物质的检测具有重要的价值[18]。电化学发光免疫分析不仅自动化程度高,而且重复性也高,其对于提高临床检查的准确率十分重要,有研究表明，电化学发光免疫分析方法检测FT4的检出率显著高于免疫放射检出率[19]，因此电化学发光免疫分析技术更能够准确的提供患者所需临床检测结果。电化学发光免疫分析法现在多用于细菌及病毒、激素和肿瘤标记物的检测等[20]，具有良好的应用前景。电化学发光免疫分析在病毒的检测应用方面，可以检测HIV、乙肝等病毒的抗原和抗体，具有快速准确的特点，适合临床筛查疾病；电化学发光免疫分析可以检测多种激素以及肿瘤标记物，如性激素6项、胰岛素等，其不仅线性范围广，而且灵敏度更高。

该研究采用了竞争电化学发光法的原理检测人血清中FT4浓度，其中，反应体系中三联吡啶钌的发光效率很高，不需要催化剂，并且具有较高的灵敏度；链酶亲合素包被的磁珠对生物素的结合力非常强，因此可以增加反应体系的灵敏度；本反应总检测时间18 min，可高效快速的检测血清总FT4含量。

综上所述，该方法具有高灵敏度、高准确度、线性范围广、稳定性好等优点，所有指标皆符合临床检测的要求。与Roche FT4试剂盒相比较，检测结果一致性好，具有较好的临床应用前景。