基于液相色谱-四极杆/飞行时间质谱血液代谢组学的黄芪桂枝五物汤干预血瘀证大鼠的研究Δ

蔡萧君，王 磊，江柏华，颉彦鹏，李浩经，王 雪，王 涛，王旭玲

(1.黑龙江省中医药科学院内分泌科，黑龙江 哈尔滨 150036； 2.襄阳市中医医院消化科，湖北 襄阳 441000)

血瘀证是中医临床上常见的证候之一，是妇科疾病的基本证型[1-6]。近年来的研究结果显示，血瘀证的病理机制与血液流变学指标异常、凝血指标异常等血液系统疾病有关。据报道，活血化瘀可以消除血瘀，改善相关的血液流变学状况。黄芪桂枝五物汤是活血化瘀的经典名方，出自《金匮要略》，由黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣组成，被广泛用于治疗血瘀证相关的妇科疾病，如痛经、闭经或月经不调，能显著改善患者的凝血功能，调节血常规指标，增加抗氧化和抗炎活性。代谢组学是一种高通量的生物分析方法，用于检测和量化小分子代谢物。利用代谢组学技术可以通过识别生物标志物、分析代谢途径和确定药物-靶点相互作用，评估疾病的变化。代谢谱分析已被用于发现生物标志物并评估许多中医疗法的整体效果。将代谢组学应用于中医药研究，可能为筛选生物活性成分和生物标志物、揭示中药复方的作用机制和获取基于复杂生物系统的科学依据提供一种新的方法[7-13]。因此，本研究采用高通量代谢组学技术研究黄芪桂枝五物汤对血瘀大鼠模型的作用机制，为黄芪桂枝五物汤治疗血瘀证提供理论及数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供30只雄性SD大鼠，体重为(200±10)g。温度和湿度分别调节在(24±1)℃和50%±5%。给予大鼠喂食标准的实验室饲料和干净的饮水。动物实验程序按照《实验动物护理和使用指南》(中国科学技术部，2006年)执行。

1.2 仪器

Agilent 1290型液相色谱仪器(美国安捷伦科技公司)；Agilent 6530型四极杆飞行时间质谱检测器(美国安捷伦科技公司)；Agilent ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm，粒径1.8 μm，内径100 μm)(美国安捷伦科技公司)。

1.3 药品与试剂

大鼠凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原(FIB)凝血功能的商用试剂盒(北京世迪科技仪器有限公司)；黄芪、桂枝、芍药、生姜和大枣购自于哈尔滨世一堂有限公司，经黑龙江省中医药科学院蔡萧君教授鉴定为正品。肾上腺素购自福州海王星福耀制药有限公司。

1.4 黄芪桂枝五物汤灌胃溶液的配制

按原方配比取黄芪9 g、桂枝9 g、芍药9 g、生姜18 g和大枣4枚，加入10倍量水煎煮1 h，共2次，合并滤液，于60 ℃真空下旋转蒸发冷凝至所需体积(生药量1 g/ml)。大鼠灌胃体积为1 ml/100 g，将药物储存在4 ℃以供进一步使用。

1.5 模型复制及样本制备

大鼠适应性饲养7 d后，随机分为空白组、模型组和给药组，每组10只。模型组、给药组大鼠于实验第7日皮下注射肾上腺素(0.8 mg/kg)2次，时间间隔4 h；在第1次皮下注射肾上腺素2 h后，将大鼠置于0～4 ℃的冰水浴中游泳4 min，以诱发急性血瘀[14]。给药组大鼠灌胃给予黄芪桂枝五物汤8 g/kg(临床剂量的1.5倍)，空白组和模型组大鼠灌胃给予等量0.9%氯化钠溶液。所有大鼠每日灌胃1次，连续7 d。

实验第15日，用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，取腹主动脉血样。部分血样(2 ml)被收集至枸橼酸钠抗凝管中，用于检测凝血指标水平(TT、PT、APTT和FIB)：首先，全血样本立即以3 000 r/min离心(离心半径为8 cm)10 min，然后使用血浆样本上清液800 μl测定凝血指标水平。其他血样用于代谢组学分析。

血浆代谢组学样品在室温(25 ℃)下解冻。于血浆样品100 μl中加入甲醇300 μl沉淀蛋白质。随后，将混合物旋涡30 s，并在13 000 r/min下离心(离心半径为16 cm)10 min。将血浆样品的上清液(200 μl)转移至新的试管中，真空下蒸发至干燥。残渣溶于70%甲醇溶液200 μl中。混合液旋涡1 min，13 000 r/min离心(离心半径为16 cm)15 min，最后注入上清液进行代谢组学分析。

1.6 代谢组学分析条件

Agilent 1290液相色谱系统，Agilent 6530 Q-TOF/MS质谱系统。柱温为40 ℃，流动相流速为0.35 ml/min，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为0.1%甲酸和乙腈。流动相梯度条件为：0～1 min，流动相A 95%；1～4 min，流动相A 95%～75%；4～6 min，流动相A 75%～40%；6～9 min，流动相A 40%～15%；9～9.5 min，流动相A 15%～5%。

1.7 数据处理与统计分析

采用Mass Profiler Professional专业软件处理血浆样本中的液质联用数据。液质联用原始数据文件被转换为通用格式，由XCMS-Online(https://metlin.scripps.edu/XCMS/)实现。XCMS-online提供了一个完整的组学工作流，包括特征检测、保留时间校正、对齐、注释和统计分析。结合保留时间和m/z数据对检测峰的各离子强度进行识别。通过过滤80%缺失值的峰和每组同位素离子的峰，获得一致的变量(离子强度信息)。

使用MetaboAnalyst 4.0平台(https://www.MetaboAnalyst.ca)进一步分析得到的数据集。采用非参数单变量法(Student’st检验)和多元统计分析(PCA、PLS-DA和OPLS-DA)选择空白组和模型组之间的差异代谢物。PCA被用来验证分析系统性能的质量，并观察可能的异常值。“Student’st检验在标准化峰面积上的P<0.05。

在线数据库HMDB(https://www.HMDB.ca/)、METLIN(https://METLIN.scripps.edu/)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)数据库(https://www.genome.jp/KEGG/)通过搜索特定代谢物的m/z峰的精确分子质量数据来注释潜在代谢物。当观察到的质量和理论质量之间的差异<10 ppm时，对其进行过滤。通过在线数据库MetPA(https://www.metaboanalyst.ca)来确定代谢途径和评估代谢物的潜在生物学作用。

2 结果

2.1 黄芪桂枝五物汤对血瘀证大鼠凝血功能的影响

凝血功能指标是评价血瘀状态的重要指标。与空白组比较，模型组大鼠的TT、PT和APTT显著缩短，FIB含量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，给药组大鼠的TT、PT和APTT明显延长，FIB含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组血瘀证大鼠凝血功能指标比较Tab 1 Comparison of coagulation index in rats with blood stasis syndrome among three groups

2.2 代谢组学结果

PCA评分图显示，空白组和模型组表现出不同的代谢特征，与空白组、给药组比较，模型组呈现相反方向的聚集，出现明显的分离趋势；给药组倾向于恢复正常水平，与空白组比较接近，见图1。采用OPLS-DA分析得到10种代谢物，通过搜索KEGG数据库(https://www.genome.jp/KEGG/)列出每种代谢物的相关途径，上述10种代谢物大多参与脂质和氨基酸代谢，见表2、图2。采用MetPA(https://www.metaboanalyst.ca)测定10个潜在的生物标志物并进行富集分析，结果见图3。给予黄芪桂枝五物汤后上述代谢物恢复至正常水平，提示上述代谢物在血浆中的变化可能表明其作为生物标志物的潜力，可以用来区分血瘀证和正常状态，对上述潜在生物标志物的有效调控可能是黄芪桂枝五物汤对血瘀大鼠模型起作用的关键。

图3 血瘀证大鼠血液代谢KEGG通路富集分析Fig 3 KEGG pathway in blood metabolism of rats with blood stasis syndrome

表2 血瘀证大鼠血液生物标志物Tab 2 Blood biomarkers in rats with blood stasis syndrome

A.正离子主成分分析图；B.负离子主成分分析图A. principal component analysis diagram of positive ions; B. principal component analysis diagram of negative ions图1 血瘀证大鼠血液的PCA得分图Fig 1 PCA score of rats with blood stasis syndrome

3 讨论

本研究成功建立了大鼠血瘀证模型，模型大鼠血液流变学指标和凝血指标发生显著变化。基于高通量代谢组学研究发现，血瘀证大鼠存在明显的代谢异常，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢，花生四烯酸代谢，苯丙氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等。给予黄芪桂枝五物汤后，各项指标和生物标志物含量均有改善趋势，证明黄芪桂枝五物汤对血瘀证有很好的治疗作用。

谷胺酸是蛋白质合成、代谢能量或糖异生的重要底物，也是神经介质的底物[15]。谷氨酸被大脑用来合成γ-氨基丁酸(GABA)，GABA是哺乳动物中枢神经系统的主要抑制性神经递质，在调节整个神经系统的神经元兴奋性方面发挥作用，直接负责调节人类的肌张力[16]。血瘀证形成后，血液循环功能障碍导致主要兴奋性神经递质谷氨酸转化为主要抑制性神经递质GABA。本研究中，模型组大鼠的L-谷氨酸含量显著低于空白组，给药组大鼠的L-谷氨酸含量升高。结果表明，L-谷氨酸可引起能量代谢失衡和血液循环功能障碍。

苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径以及苯丙氨酸代谢与L-苯丙氨酸有关[17]。苯丙氨酸在组织中可以转化为酪氨酸。值得注意的是，苯丙氨酸代谢的稳定性可以保持身体生长和正常功能。本研究建立的血瘀证模型显示，在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径中，代谢物苯丙氨酸的代谢异常。L-苯丙氨酸不能转化为L-酪氨酸，改变了苯丙氨酸与酪氨酸的比例，导致L-苯丙氨酸大量蓄积。与模型组相比，给药组大鼠的L-苯丙氨酸浓度降低。这可能是由于给药后，大鼠体内的L-苯丙氨酸可以生物转化为L-酪氨酸，表明黄芪桂枝五物汤能恢复正常的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，使L-苯丙氨酸浓度降低。

A.花生四烯酸；B.溶血磷脂酸[18：1(9Z)/0：0]；C.溶血磷脂酸(16：0/0：0)；D.溶血磷脂胆碱(P-18：0)；E.L-谷氨酸；F.肌酸；G.L-精氨酸；H.L-亮氨酸；I.L-色氨酸；J.L-苯丙氨酸A. arachidonic acid; B. lysophosphatidic acid[18：1(9Z)/0：0]; C. lysophosphatidic acid (16：0/0：0); D. lysophosphatidylcholine (P-18：0); E. L-glutamic acid; F. creatine; G. L-arginine; H. L-leucine; I. L-tryptophan; J. L-phenylalanine图2 血瘀证大鼠模型血液生物标志物相对含量图Fig 2 Relative content of blood biomarkers in rats with blood stasis syndrome

酪氨酸是L-色氨酸的代谢物，是炎症和恶性肿瘤研究领域中一种重要的色氨酸代谢物，具有免疫抑制作用。蓄积的犬尿氨酸可促进活化Th细胞凋亡，诱导免疫抑制Treg细胞分化，从而抑制免疫反应[18-20]。酪氨酸是犬尿氨酸的下游产物，其含量的高低会直接影响酪氨酸的含量，进而影响色氨酸含量。除酪氨酸外，色氨酸的另一个重要分解途径为5-羟色胺途径。肠嗜铬细胞分泌的5-羟色胺进入血液，被血小板主动吸收，当血小板与血块结合时，会释放血清素，血清素起到血管收缩作用，有助于调节止血和凝血。本研究中，与空白组大鼠相比，模型组大鼠体内L-色氨酸含量差异显著，差异有统计学意义(P<0.05)。急性血瘀证模型建立后，L-色氨酸浓度显著升高，色氨酸代谢发生改变。L-亮氨酸参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，调节血糖，为身体提供能量。亮氨酸是一种支链氨基酸，也是重要的生酮氨基酸。支链氨基酸可促进蛋白质的合成和转换、信号传导和葡萄糖的整体代谢。模型组大鼠的L-亮氨酸浓度明显低于空白组，亮氨酸的减少可能是亮氨酸生物合成减少所致。

黄芪桂枝五物汤的临床应用广泛、效果明显，是治疗血瘀证相关疾病的常用中药方剂。本研究首次采用高通量的代谢组学研究技术对黄芪桂枝五物汤治疗血瘀证大鼠进行研究，通过非靶向研究策略结合高分辨质谱检测手段成功获取黄芪桂枝五物汤治疗血瘀证过程中的关键节点和关键代谢物，为阐明血瘀证的深层机制提供了数据依托。但本研究以动物实验为切入点，实验结果与临床样本的拟合程度还有待研究，生物标志物在人体的代谢机制和网络互做关系还需进一步详细研究。