气相二氧化硅纳米粒子掺杂的新型两性杂化整体柱的制备及其在加压毛细管电色谱中的应用

潘虹 刘让东 王薇薇 王彦 阎超

摘 要 以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）和乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为功能性单体，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，加入γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅（γ-MAPS）修饰的气相SiO2纳米粒子（MFSNP），在二元致孔剂环己醇及十二烷醇的作用下，通过原位聚合反应形成杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱。进一步通过GMA的开环反应，将苯丙氨酸（Phenylalanine）键合在杂化整体柱表面，制备了气相SiO2纳米粒子掺杂的新型杂化整体柱Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）。对制备整体柱的各反应物配比和苯丙氨酸的修饰条件等进行优化，在最优条件下制备的整体柱为一类两性离子整体柱，具有反相和离子交换结合的混合分离机制。将此整体柱用于加压毛细管电色谱时，烷基苯、多环芳烃、苯甲酸类和苯酚类小分子以及多肽的分离效果良好，其中甲苯的分离柱效最高， 可达122592 N/m。

关键词 气相二氧化硅纳米粒子; 苯丙氨酸; 杂化整体柱; 加压毛细管电色谱

1 引 言

加压毛细管电色谱（Pressurized capillary electrochromatography，pCEC）是一种新型的电动微分离技术，兼有毛细管液相色谱（Capillary liquid chromatography，cLC）的高选择性和毛细管电泳（Capillary electrophresis， CE）的高柱效、高分辨率及快速分离的特点。基于加压毛细管电色谱平台，不仅一些易电离的酸、碱及两性物质可得到分离，不易电离的中性物质也能够得到分离[1]。

毛细管柱作为毛细管色谱仪器的核心组件，直接影响分离效果。常见的毛细管柱可分为填充柱和空管柱。空管柱多用于毛细管电泳的分离，而填充柱则适用于加压毛细管电色谱。整体柱作为一种新型色谱填充固定相，被誉为第四代色谱固定相，克服了二氧化硅填充柱的柱塞效应，并且可以引入多种功能性基团，是近年色谱领域的研究热点[2]，尤其是掺杂有纳米材料的整体柱固定相更是发展迅速。在高效液相色谱（High performance liquid chromatography HPLC）或毛细管电色谱（Capillary electrochromatography CEC）的平台上，掺杂有纳米材料的整体柱可用于多种化合物的分离[3～7]。按照纳米材料的引入方式，可分为后修饰和包埋两种方式： 后修饰[8]是在整体柱制备完成后，再通过共价键或静电相互作用，将纳米材料键合到其孔隙表面; 包埋[9]即将纳米材料掺杂到整体柱预聚合反应液内，与单体共同反应，具有制备方法简单方便、易操作等优点。Lei等[10]将3种核壳型纳米粒子掺杂到poly（BMA-EDMA）中，制得杂化整体柱，发现杂化整体柱的比表面积显著增大，在CEC分离模式下，有机酸的分离选择性和柱效都有所提高。

气相SiO2纳米粒子（Fumed silica nanopartilces，FSNP）粒径小，比表面积大，其表面的硅羟基易于用功能性试剂修饰，从而可将修饰后的FSNP通过键合的方式嫁接到整体柱内部。另外，经修饰后的FSNP上的残余硅羟基还可进一步改性。Aydoan等[11]将表面修饰乙烯基的FSNP掺杂到poly（GMM-EDMA）聚合整体柱内，在纳米粒子的硅羟基上修饰碳十八烷基，在HPLC模式下，分离效果明显提高，可用于苯酚类、苯胺类小分子和标准蛋白质的分离。

本研究以γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅（γ-Methacryloxypropyltrimethoxy silane）对FSNP进行表面改性，合成了甲基丙烯酰基修饰的气相SiO2纳米粒子（Methacryloyl fumed silica nanoparticle，MFSNP），并将其掺杂入poly（GMA-EDMA）聚合物反应液中，合成杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱，并进一步通过开环反应将苯丙氨酸修饰到杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的表面，合成了一种新型两性杂化整体柱Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）。将此整体柱应用于pCEC，可实现多种小分子和多肽的良好分离。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

TrisepTM2100加压毛细管电色谱仪（美国Unimicro Technologie公司）; S-4800场发射扫描电子显微镜（SEM，日本电子株式会社）; IR/Nicolet 6700红外光谱仪（美国Thermo Nicolet公司）; 石英毛细管柱（100 μm i.d. × 360 μm o.d.，河北永年锐沣色谱器件公司）。

乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）（色谱纯， 美国Tedia公司）; 甲基丙烯酸甘油酯（GMA，97%，美国Acros Organics公司）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，98%，美國Sigma-Aldrich公司）、偶氮二异丁腈（AIBN，上海试四赫维公司）、γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅（γ-MAPS，北京百灵威公司）; NaH2PO4、Na2HPO4（上海凌峰化学试剂有限公司）; 硫脲、丙苯、丁苯、环己苯、苊、菲、荧蒽、没食子酸、间羟苯甲酸、3，5-二羟基苯甲酸、间苯三酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; L-苯丙氨酸、苯甲酸、甲苯、乙苯、4-硝基苯酚、水杨酸（国药集团化学试剂有限公司）; 对苯二酚、间苯二酚、间甲酚、邻苯二酚（中国医药集团有限公司）; 萘（上海化学试剂采购供应站）; 苯并[a]蒽（美国Accustandard公司）; DE-11（97.05%）、DE-10（98.95%）（上海GL Biochem公司）; 缓激肽（Bradykinin）、蛋氨酸-脑啡肽（Met-Enkephalin）、Subtance P（≥95.0%， 上海生工生物工程公司）; 气相SiO2纳米粒子（Fumed silica nano-particle， FSNP，Aerosil 2000，粒径为12 nm，比表面积为（200±25） m2/g，德国Degussa AG公司）。

2.2 甲基丙烯酰基修饰的气相SiO2纳米粒子（MFSNP）的合成

采用γ-MAPS对FSNP表面烯基化[12]： 称取1g FSNP于50 mL圆底烧瓶中，加入25 mL 乙醇和5.2 mL HCl溶液。超声混合均匀后，磁力搅拌并升温至80℃，并在升温过程中逐滴加入3.6 mL γ-MAPS， 整个反应持续6 h。反应结束后，用水和无水乙醇洗涤至中性，45℃烘干，得到的产物即为甲基丙烯酰基化的气相SiO2纳米粒子（MFSNP），备用。

2.3 Poly（GMA-EDMA）整体柱和杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的制备

2.3.1 Poly（GMA-EDMA） 整体柱的制备 制备毛细管整体柱前，先用γ-MAPS对石英毛细管空管进行硅烷化预处理[13]。称取GMA（30%， w/w）、EDMA（30%， w/w）、十二烷醇（30%， w/w）、环己醇 （30%， w/w）及单体质量1%（w/w）的AIBN加入1.5 mL 离心管内，涡旋混合均匀，超声至澄清透明状态，得到poly（GMA-EDMA）聚合物混合液。在上述混合液中通N2约5 min后，将该聚合物溶液填入到γ-MAPS预处理过的毛细管空管中，有效填入长度为25 cm（总长50 cm）。用橡胶塞密封毛细管柱两端，放入60℃水浴中反应12 h。反应结束后，用甲醇冲洗，除去未反应的单体和致孔剂，制备得到poly（GMA-EDMA） 整体柱。

2.3.2 杂化Poly（GMA-EDMA-MFSNP） 整体柱的制备 称取适量2.2节制备的MFSNP，加入到poly（GMA-EDMA）聚合物混合液中，形成浓度为10 mg/mL的悬浊液，涡旋并超声，使MFSNP均匀分散。在上述悬浊液中通N2约5 min后，将聚合物溶液填入到γ-MAPS预处理过的毛细管空管中，有效填入长度为25 cm（总长50 cm）。用橡胶塞密封柱毛细管柱两端，放入60℃水浴中反应12 h。反应结束后，用甲醇冲洗，除去未反应的单体和致孔剂，制得杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP） 整体柱。

2.4 苯丙氨酸修饰的3种整体柱的制备

2.4.1 Phe-poly（GMA-EDMA） 整体柱的制备 称取适量苯丙氨酸，用50 mmol/L NaH2PO4（pH 8）溶解，配制成0.1 mol/L苯丙氨酸溶液。将1 μL上述溶液注入到2.3节中制备的poly（GMA-EDMA）整体柱中，然后用橡胶塞密封毛细管柱两端，放入60℃水浴中反应12 h。反应结束后，用水和甲醇冲洗除未反应的苯丙氨酸，制备得苯丙氨酸修饰的Phe-poly（GMA-EDMA）整体柱。

2.4.2 杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的制备 制备方法同2.4.1节，不同之处是将poly（GMA-EDMA）整体柱更换为2.3节制备的杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP） 整体柱。

2.4.3 空白对照杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的制备 为考察苯丙氨酸修饰杂化整体柱的效果，同时用不含苯丙氨酸的空白溶剂50 mmol/L NaH2PO4（pH=8）同法处理2.3节制备的杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）， 作为空白对照杂化整体柱，记作空白对照杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱。

2.5 整体柱性能考察

2.5.1 渗透率K的测定 在室温条件下，采用毛细管液相色谱分离模式，以甲醇为流动相，根据公式K=μLΔP×η[14]，测定整体柱的渗透率K。其中，μ为甲醇通过毛细管整体柱的线性流速，ΔP为甲醇通过毛细管整体柱的柱压，L为毛细管整体柱的有效长度，η为甲醇在室温下的动态粘滞度（0.58×10x3 Pa·s）。

2.5.2 电渗流的测定 以硫脲为电渗流分析物，在cLC和pCEC两种模式下，根据公式μEOF=μeoE=Le/t02-Le/t01V/Lt [15]（1）计算电渗流（μEOF）大小。

其中，E为所施加的电场强度，Lt为整体柱的总长度，Le为整体柱的有效长度，t01和t02为硫脲分别为在cLC和pCEC模式下的保留时间。

2.5.3 色谱性能考察 在cLC和pCEC模式下，将毛细管整体柱用于分离不同类型的化合物，考察其色谱性能。毛细管整体柱规格为 25 cm （总长50 cm） × 100 μm（I.D.），分流前进样环体积约为1 μL，分流比约为100∶1，实际进样量为10 nL。采用整体柱每米的理论塔板数计算柱效。保留因子（k）的计算公式如下：k=tm-t0t0（2）其中， tm为所测分离物质的保留时间，t0为中性物质的保留时间，本實验采用硫脲为中性物质。

3 结果与讨论

3.1 5种整体柱的制备流程

本研究共制备了5种类型的整体柱，以考察杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的效果，如图1所示。首先，以GMA和EDMA为单体，以十二烷醇和环己醇为致孔剂，通过原位聚合，制得poly（GMA-EDMA）整体柱; 其次，在聚合物反应液中加入γ-MAPS修饰的气相SiO2纳米粒子（MFSNP），并通过原位聚合，制得掺杂MFSNP的杂化poly（GMA-EDMA-MFASNP）整体柱; 再次，在这两种整体柱上，通过进一步开环反应，修饰苯丙氨酸（Phenylalanine），分别制得Phe-poly（GMA-EDMA）整体柱和杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱，这两种整体柱后续可以用于考察掺杂MFSNP对于整体柱分离性能的影响。另外，为了比较苯丙氨酸修饰对杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱性能的影响，本研究还采用空白溶剂50 mmol/L NaH2PO4（pH=8）替代苯丙氨酸/NaH2PO4 溶液，制备了空白对照杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱。

3.3 杂化整体柱poly（GMA-EDMA-MFSNP）配方的优化

3.3.1 Poly（GMA-EDMA） 整体柱配方优化 首先对不含MFSNP的纯聚合物整体柱poly（GMA-EDMA）配方进行优化，见表1。将AIBN设为GMA和EDMA质量之和的1%[17]，当单体中GMA和EDMA质量比为3∶1， 致孔剂中环己醇和十二烷醇质量比为1∶1时，改变单体与致孔剂之间的比例，其结果见表1中的1、2、3、4号柱。当致孔剂的量减小时，整体柱渗透性降低，当单体和致孔剂质量比为40∶60时，整体柱柱效最高，因此确定单体与致孔剂的最佳质量比为40∶60。

当单体和致孔剂质量比为40∶60，致孔剂中环己醇和十二烷醇质量比为1∶1时，改变单体中GMA与EDMA的比例，其结果可见表1中的2、5、6、7号柱。当GMA比例增大，整体柱的渗透性略有减小，在GMA比例达到30%即GMA和EDMA质量比为3∶1 时，整体柱柱效最高，继续增大GMA的比例，柱效下降。因此，选择GMA∶EDMA的最佳比例为3∶1。

对致孔剂中环己醇和十二烷醇的比例进行优化，见表1中的2、8、9号柱。当单体与致孔剂的质量比为40∶60，单体中GMA与EDMA的质量比为3∶1时，增大十二烷醇的比例，整体柱的渗透性增大; 当十二烷醇的比例为30%，即十二烷醇与环己醇的质量比为1∶1时，柱效最高。因此，将十二烷醇和环己醇的最佳比例确定为1∶1。

综上所述，poly（GMA-EDMA）整体柱的最佳配方为单体和致孔剂质量比为40∶60，GMA与EDMA的质量比为3∶1，环己醇与十二烷醇的质量比为3∶1，实验结果见表1。

3.3.2 杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱中掺杂MFSNP浓度的优化 在柱2的基础上，将MFSNP掺杂到聚合物混合液中，混合均匀后抽入毛细管柱内，制作杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱。本实验考察了不同浓度MFSNP对整体柱性能的影响，如表2所示。3.4 苯丙氨酸修饰条件的优化

上述合成的杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱骨架内几乎没有带电物质，因此只能产生微弱的电渗流，不适用于pCEC平台。所以在杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱表面引入苯丙氨酸，苯丙氨酸中的氨基可与GMA中的环氧基团发生开环反应，键合在其表面，未反应的羧基和反应后的仲胺基团为带电离子，可以产生电渗流。并且苯丙氨酸上的苯环可以增强杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱疏水作用，从而提高对疏水性分析物的分离效率。根据产生电渗流的大小，本研究对反应所需的苯丙氨酸的浓度和反应时间进行优化。以硫脲为测定电渗流大小的分析物，20 mmol/L PBS为缓冲溶液，在10 kV电压作用下，测定整体柱的电渗流μEOF，结果见图3。当苯丙氨酸的浓度为 0.10 mol/L时， μEOF最大; 当苯丙氨酸与整体柱反应12 h时， μEOF最大。3.5 Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱性能考察

3.5.1 整体柱的形貌特征 根据苯丙氨酸的最佳修饰条件，将其键合在杂化整体柱和纯聚合物整体柱表面，分别得到杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱和Phe-poly（GMA-EDMA）整体柱，其场发射扫描电镜图见图4A和4B，图4C为未修饰苯丙氨酸的杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的扫描电镜图。MFSNP 的平均粒径为12 nm，比表面积为 （200 ± 25） m2/g。从图4A可见，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP） 整体柱内部呈多孔结构，固定相和毛细管壁结合紧密，固定相内部团聚物分布較均匀。对比图4A和4B可知，相比Phe-poly（GMA-EDMA） 整体柱，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱内部团聚物分布更均匀，结构更小，比表面积增大，有利于提高整体柱柱效。对比4A和4C可知，修饰苯丙氨酸前后，杂化poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱内部结构未发生明显改变。

3.5.2 Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）的分离机理考察 在cLC模式下，考察了Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）的分离机理。从图5可见，随着ACN浓度（45%～70%， V/V）增大，甲苯、乙苯和萘的保留因子k明显减小，说明此整体柱呈反相分离机理。

此外，当流动相缓冲液pH值在2.5～3.7范围内，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的电渗流向阳极移动，pH值越小，阳极电渗流越大（图6）。这可能是由于苯丙氨酸的仲胺在酸性条件下带正电荷，而羧酸的电离受到抑制; 随着pH值增大，仲胺离子的电离减弱，羧酸的电离增强，在pH=3.7时，苯丙氨酸表面电荷基本为0，几乎没有电渗流。在pH 3.7～9.0范围内，羧酸的电离程度大于仲胺，因此苯丙氨酸表面带负电，产生阴极电渗流，与文献[18]报道结果基本一致。综上，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）为两性柱，既可产生阳极电渗流，又可产生阴极电渗流，这也说明苯丙氨酸成功键合在整体柱表面。

3.5.3 杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱和Phe-poly（GMA-EDMA）整体柱的对比 在运行电压15 kV，流动相包含10 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.21）的条件下，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱可对包括硫脲在内的6种多环芳烃进行基线分离。在同样条件下，虽然不含MFSNP的纯聚合物整体柱Phe-poly（GMA-EDMA）也可对这6种小分子进行分离，但是分离柱效不及杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱，如表3所示。这说明加入MFSNP可以改善整体柱性能，使其表面积增大，内部结构均匀，从而提高了整体柱的柱效。

3.5.4 雜化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱与空白对照poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱电渗流对比 制备一个空白对照柱，即空白对照杂化整体柱poly（GMA-EDMA-MFSNP）。杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP） 整体柱和空白对照柱poly（GMA-EDMA-MFSNP）在cLC模式和pCEC模式下对硫脲和甲苯的分离效果见图7。相对于cLC模式，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP） 整体柱在10 kV电压作用下，硫脲和甲苯的保留时间明显缩短，分离速度加快; 而空白对照柱poly（GMA-EDMA-MFSNP）在10 kV电压作用下，保留时间的缩短并不明显。3.5.5 杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱对小分子的分离 在pCEC模式下，运行电压为15 kV时，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱可对包括硫脲在内的6种中性烷基苯小分子进行完全分离。其中甲苯的柱效可以达到122592 N/m，乙苯、丙苯、丁苯和环己苯的柱效分别为126211、125930、122973和116088 N/m，分离色谱图如图8A所示。据文献[19]报道，poly（GMA-EDMA）整体柱经苯丙氨酸修饰后，可以实现对甲苯、乙苯、丙苯和丁苯的分离，其柱效分别为56700、44500、34500和34600 N/m。将该结果与本实验结果进行对比，杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱的柱效明显更高，这再次证明加入MFSNP可提高整体柱柱效。

3.5.6 杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱对多肽的分离 杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱表面键合的苯丙氨酸既含仲胺基团，又有羧基，是一种两性离子整体柱，其既具有离子交换的分离机理，

4 结 论

以渗透性和柱效为考察指标，对poly（GMA-EDMA）整体柱的配方进行优化，在优化的配方中加入了γ-（甲基丙烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）修饰的气相SiO2纳米粒子（MFSNP），使其共价结合在poly（GMA-EDMA）内部，并进一步通过苯丙氨酸修饰，制备了新型杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱。此杂化Phe-poly（GMA-EDMA-MFSNP）整体柱渗透性良好，内部结构分布均匀，其电渗流方向随缓冲液pH值变化而变化，是一种两性离子整体柱，且具有反相和离子交换相结合的混合分离模式，对小分子和多肽化合物都可以进行良好的分离。本研究为制备新型杂化整体柱的研究和发展提供了借鉴。

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