基于网络药理学及分子对接技术探讨荆防颗粒治疗流感的作用机制Δ

黄佳奇，谭影影，陈美琳，李佳霖，张景媛，段小霞，翟弋焱，时 锐，吴嘉瑞#

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488; 2.北京泽桥传媒科技股份有限公司，北京 100176)

流行性感冒(简称“流感”)是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，临床表现包括咳嗽、鼻塞、头痛和咽喉痛等[1]。人流感病毒由于核蛋白和内膜抗原蛋白的不同可分为甲、乙和丙3型[2]。荆防颗粒由荆芥、防风、羌活、独活、柴胡、前胡、川芎、枳壳、茯苓、桔梗和甘草等11味药组成，具有发汗解表、散风祛湿的功效[3]。本研究利用网络药理学的方法预测荆防颗粒治疗流感的成分、靶点，并通过分子对接技术进行验证，为进一步的研究提供基础。

1 资料与方法

1.1 荆防颗粒相关化学成分及靶点信息查找

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)查找荆防颗粒的成分，并以药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件，筛选各药材的成分，并通过TCMSP查找成分对应的靶点。通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“influenza”为关键词查找流感的疾病靶点；根据Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，将流感靶点的蛋白名转化为基因名。利用在线工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，将荆防颗粒的靶点与流感的靶点进行交集，得到荆防颗粒治疗流感的潜在靶点。

1.2 “药物-成分-潜在靶点”网络构建

利用Cytoscape 3.7.2软件，将荆防颗粒的成分及潜在靶点进行可视化处理，构建“药物-成分-潜在靶点”网络。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein Interaction，PPI)网络分析

将潜在靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)，设置物种为“Homo sapiens”，进行PPI网络分析，利用Cytoscape 3.7.2构建PPI网络。

1.4 基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

将潜在靶点通过Rstudio进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。通过PATHVIEW网站(https://pathview.uncc.edu/analysis)显示出富集通路的基因，利用Portable Pathway Builder Tool 2.0软件将通路可视化。

1.5 分子对接

通过TCMSP获得荆防颗粒成分的结构信息，通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)得到靶蛋白的3D结构。利用AutodockTool软件对小分子和靶蛋白进行加氢、计算电荷和合并非极性氢等前处理，利用Autodock Vina软件对二者进行对接，通过PyMOL 2.3.0软件将对接结果可视化。

2 结果

2.1 荆防颗粒成分和靶点信息

收集到11味药共220个成分，去除未查得靶点的成分后再去重得到159个成分。查得荆防颗粒的靶点3 531个，去除未能成功转化为基因名的靶点并去重得到248个靶点。

2.2 共有靶点库的建立

查得流感的靶点2 574个，取“Relevance”大于中位数的靶点，筛选2次得到665个靶点。与荆防颗粒的靶点取交集得到荆防颗粒治疗流感的54个潜在靶点，见图1。

图1 VENN图Fig 1 Venn diagram

2.3 “药物-成分-潜在靶点”网络

“药物-成分-潜在靶点”网络见图2，图中菱形节点代表荆防颗粒治疗流感的潜在靶点，圆形节点代表荆防颗粒的成分，正方形节点代表荆防颗粒的11味药材，节点大小与其度值(Degree)成正比。槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、金合欢素(acacetin)和丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)等成分Degree较高，可能是荆防颗粒治疗流感的关键成分。靶蛋白PTGS2、PRSS1、MAPK14、ADRB2和RELA的Degree较高，Degree≥10。

图2 “药物-成分-潜在靶点”网络图Fig 2 “Drug-components-potential targets” network

2.4 PPI网络分析

荆防颗粒治疗流感的潜在靶点相互作用网络见图3，图中节点大小以及颜色深浅与其Degree成正比。白细胞介素(IL)6、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子-A(VEGFA)、转录因子AP-1(JUN)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)和IL-1β等节点的Degree较高，与其他蛋白关系密切。

图3 PPI网络图Fig 3 PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析

GO和KEGG分析结果见图4—5。荆防颗粒可调节信号受体结合、酶结合、含蛋白质的复合物结合、细胞因子受体结合和细胞因子活性等分子功能，作用于细胞外区域、细胞外空间、细胞质囊泡和细胞内囊泡等细胞组分，参与细胞对化学刺激的反应、细胞对有机物的反应、细胞死亡和程序性细胞死亡等生物过程。甲型流感信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路和IL-17信号通路等可能是荆防颗粒治疗流感的关键通路。

图4 GO功能富集分析Fig 4 GO functional enrichment analysis

图5 KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接

选取PTGS2、PRSS1、ADRB2、MAPK14、CASP3、JUN和RELA作为分子对接的靶蛋白，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮素和汉黄芩素作为分子对接的小分子，结合能最低的9组对接结果见表1。结合能越低，小分子与靶蛋白之间的亲和力越高，结合效果越好。选取结合效果最好的5组进行展示，见图6。

表1 分子对接结果Tab 1 Results of molecular docking

A.ADRB2-luteolin；B.PTGS2-luteolin；C.PTGS2-quercetin；D.ADRB2-quercetin；E.ADRB2-beta-sitosterolA.ADRB2-luteolin；B.PTGS2-luteolin；C.PTGS2-quercetin；D.ADRB2-quercetin；E.ADRB2-beta-sitosterol图6 分子对接结果Fig 6 Results of molecular docking

2.7 荆防颗粒治疗流感的通路分析

选取Influenza A通路进行展示，见图7—8。图7中，深色方块代表荆防颗粒作用的靶点；图8中，P代表磷酸化，箭头代表促进作用，星形标注的靶点是荆防颗粒作用的靶点。荆防颗粒可作用于核因子κB(NF-κB)、IL-1、IL-6、TNF-α和IFN-γ调控Influenza A通路，通过调节病毒引起的先天免疫反应、促进细胞因子释放，影响流感病毒RNP的释放以及病毒蛋白的表达控制病毒感染。

图7 荆防颗粒干预Influenza A通路图Fig 7 Pathway of Influenza A intervened by Jingfang granules

图8 荆防颗粒干预Influenza A 核心通路示意图Fig 8 Core pathway of influenza A intervened by Jingfang granules

2.8 “药物-成分-靶点-通路”网络

荆防颗粒治疗流感的“药物-成分-靶点-通路”网络见图9，图中正方形节点代表荆防颗粒，三角形节点代表药物，菱形节点代表成分，圆形节点代表靶点，正六边形节点代表通路。

图9 “药物-成分-靶点-通路”网络Fig 9 “Drug-components-targets-pathway” network

3 讨论

荆防颗粒由11味中药组成，其中荆芥、防风为君药，有发汗解表散风之效；羌活、独活为臣药，祛一身风寒湿邪；柴胡、川芎、桔梗、枳壳、前胡和茯苓共为佐药；甘草调和诸药，为使药；诸药合用，共奏发汗解表、散风祛湿之效[4]。

通过“药物-成分-潜在靶点”网络发现，荆防颗粒可能通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分作用于PTGS2、PRSS1和ADRB2等靶点发挥治疗流感的作用。槲皮素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗炎症的作用，影响流感病毒mRNA的合成、病毒的组装及释放[5-6]。木犀草素能够干扰IAV外壳蛋白Ⅰ复合物的表达，抑制H1N1导致的细胞病变，下调流感病毒H1N1激活的凋亡通路[7-9]。山柰酚与M2蛋白有较高的结合亲和力，能够阻断神经氨酸酶的活性位点，抑制TLR4/MyD88介导的NF-κB和MAPK通路的激活，从而抑制炎症介质过量产生[10-12]。汉黄芩素能够抑制TLR7介导的MyD88依赖性信号通路及NF-κB p65的核转位和表达，抑制流感病毒感染后肺泡巨噬细胞内炎症因子的产生，发挥抗炎作用[13-14]。PTGS2具有抗炎、抗氧化的作用，与炎症病理过程密切相关[15]。MAPK14参与调节炎症反应，被激活后可以调节炎症介质的产生以及细胞的增殖、分化[16-17]。ADRB2即β2-AR，可介导NE诱导细胞分泌IL-10，控制炎症[18]。RELA与炎症调节、免疫应答等生命活动密切相关[19]。CASP3、CASP8与细胞焦亡密切相关[20]。木犀草素能下调CASP3、CASP8的表达，干预流感病毒诱导的细胞凋亡[8]。因此，荆防颗粒治疗流感的作用机制可能与抑制流感病毒复制，干预炎症反应和免疫应答有关。

GO功能富集分析结果发现，荆防颗粒可能通过调节信号受体结合、细胞因子受体结合和分子功能等过程，参与调控细胞死亡、细胞对相关刺激的反应，发挥抗流感病毒的作用。甲型流感信号通路图显示，荆防颗粒参与了流感病毒的先天免疫逃避、细胞因子抗感染、细胞死亡、流感病毒RNP的输出和流感病毒蛋白的表达等过程，并涉及到MAPK信号通路。MAPK通路是生物体内的信号传导通路，可以将细胞外刺激信号，如细胞因子、炎症反应等信号，从细胞膜传导至细胞核内，参与多种生理病理过程，影响细胞生长的各阶段，如细胞的生长、增殖和迁移等活动都会受到MAPK通路的调控[21-22]。说明荆防颗粒治疗流感可能与干预细胞死亡、抑制流感病毒的表达和调节免疫反应有关。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接的方法，初步揭示了荆防颗粒治疗流感的分子机制，为进一步的研究提供了基础。