苯丙氨酸、茉莉酸甲酯对百里香不定芽基础代谢及精油提取率的影响

2016-06-14李晓东徐世千张建国鲁朝辉于燕

江苏农业科学 2016年4期

李晓东+徐世千+张建国+鲁朝辉+于燕

摘要：以离体培养的百里香不定芽为材料，研究添加不同浓度苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）对不定芽生长过程中基础生理代谢、精油提取率的影响。结果表明：添加供试浓度Phe、MJ显著提高了百里香不定芽中可溶性蛋白、可溶性糖含量，其含量随着Phe、MJ浓度的上升呈先上升后下降的趋势；适宜浓度的Phe、MJ增强不定芽中SOD、POD、PAL活性，抑制PPO活性，且具有明显的浓度效应，其中添加100 mg/L Phe、150 mg/L MJ效果最佳。在此基础上，提取了百里香精油，添加100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ的提取率分别为042%、0.39%，分别比对照（0.31%）高35.5%、25.8%。

关键词：苯丙氨酸；茉莉酸甲酯；百里香；生理代谢；精油提取率

中图分类号： S567.23+9.01

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0245-05

百里香（Thymus vulgaris L.）是唇形科（Lamiaceae）百里香属（Thymus）多年生芳香植物，是一种重要的芳香和药用植物，同时也可作为环保、观赏以及蜜源植物，极具开发价值[1]。百里香植株花茎叶可提取芳香油，百里香精油是重要的天然香料、天然防腐剂以及天然抗氧化剂，具有广泛的商业价值[2-4]，其主要成分百里酚、香芹酚可以预防和治疗人类疾病[5]；同时百里香提取物还具有化感作用[6-7]，有望成为新型的生物除草剂。百里香精油的市场需求日益增大，但是野生百里香资源有限，而且栽培百里香的生长周期长且提取率很低。因此，人们开始尝试利用各种途径提高次生代谢产物的产量，其中刺激剂的利用是最有效的方法之一。

苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）是植物必需的一种氨基酸，它可以作为碳源以及通过参与蛋白质的合成来影响植物的生长发育；同时，在植物细胞的次生代谢中，苯丙氨酸还是合成一些木质素、生物碱、黄酮、异黄酮以及香豆素等次生物质的重要前体[8]。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）是一类新确认的植物内源生长调节物质，它能调节植物体保护酶活性及次生代谢酶类活性，促进基因表达，诱导蛋白质及次生物质的合成[9]。已有研究表明，用10 μmol/L苯丙氨酸处理大豆悬浮细胞48 h后，悬浮细胞中大豆素含量增加为对照细胞的1.3倍，同时染料木素含量增加为对照的1.38倍[10]。罗建平等报道，用200 μmol/L茉莉酸甲酯处理怀槐悬浮培养细胞9 d后，可以使悬浮细胞中的异黄酮含量增加41718%[11]。本研究主要探讨不同浓度的苯丙氨酸、茉莉酸甲酯处理对百里香不定芽中SOD、POD、PPO、PAL等保护酶活性以及可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响，从而筛选出最佳添加浓度并进行精油的提取，为利用苯丙氨酸、茉莉酸甲酯调控百里香次生代谢产物含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为百里香（Thymus vulgaris L.）不定芽，品种名为冬季百里香。

1.2 材料培养与处理

百里香不定芽培养的对照培养基为MS+0.25 mg/L NAA+0.25 mg/L 6-BA，附加0.6%琼脂、3%蔗糖；在对照培养基中分别添加50、100、150、200、250 mg/L苯丙氨酸组成5水平的苯丙氨酸处理培养基；在对照培养基中分别添加50、100、150、200、250 μmol/L茉莉酸甲酯组成5水平的茉莉酸甲酯处理培养基。灭菌前调节pH值至5.8～6.0，其中苯丙氨酸、茉莉酸甲酯采用过滤灭菌，每种培养基接种20瓶，每瓶接种0.5 g不定芽，培养室温度（25±2） ℃，光照度2 000～2 500 lx，光照周期12 h/d。

1.3 生理指标的测定

百里香不定芽生长60 d后，取各个处理的芽体较幼嫩部分0.5 g进行生理指标的测定，每个处理3次重复。采用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白鲜质量含量；蒽酮比色法测定可溶性糖鲜质量含量；依据超氧化物歧化酶（SOD）抑制氮蓝四唑（NBT）在光照下的还原程度来确定活性的大小，1 min 抑制NBT光化还原的50%为1个SOD活性单位（U）；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定，以1 min D470 nm变化0.01为1个酶活性单位（U）；多酚氧化酶（PPO）采用儿茶酚法测定，以1 min内D525 nm变化0.01为1个酶活性单位（U）；苯丙氨酸解氨酶（PAL）采用紫外吸收法测定，以1 min D290 nm变化0.01为1个酶活性单位（U）。以上生理指标的测定均参照王学奎的方法[12]。

1.4 精油的提取

切取百里香全苗，于自然条件下阴干，然后粉碎并置于 1 L 圆底烧瓶中，按1 g ∶10 mL料液比加入蒸馏水。采用水蒸气蒸馏法，蒸馏时间为微沸3.0～3.5 h，将挥发油经正己烷萃取，保存于2 mL Agilent样品瓶中，置于4 ℃冰箱中待测。

1.5 数据分析

试验数据经整理后输入Excel 2007进行处理，应用SPSS 16.0统计软件进行方差分析和LSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同刺激剂浓度对百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影响

2.1.1 苯丙氨酸浓度对百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影响由图1可以看出，添加50～250 mg/L Phe均不同程度地提高了不定芽中可溶性蛋白的含量，且添加物处理与对照相比，均达到了显著差异（P<0.05）；当加入 100 mg/L Phe时，不定芽中的可溶性蛋白质的鲜质量含量达到最高值3.21 mg/g，比对照极显著提高了87.48%（P<001）；当增加Phe的浓度时，其增加的幅度在下降。由此可知，Phe的最佳浓度为100 mg/L，可溶性糖含量反映了体内作为有效营养物的碳水化合物和能量水平。

由图2可以看出，添加Phe后对不定芽中可溶性糖的影响与可溶性蛋白的影响相似，各个Phe浓度的处理的可溶性糖含量均显著高于对照组，其中100 mg/L Phe可溶性糖的鲜质量含量高达7.89 mg/g，极显著高于其他处理。

2.1.2 茉莉酸甲酯浓度对百里香不定芽中可溶性糖、可溶性蛋白含量的影响由图3可以看出，在MJ处理下，极大地提高了不定芽中可溶性蛋白含量，说明添加MJ后细胞代谢更加活跃，促进了蛋白质的大量合成。在50～150 μmol/L的浓度范围内，随着MJ浓度的升高，促进作用增强；MJ浓度为 150 μmol/L 时，可溶性蛋白含量达到最大值7.66 mg/g，为对照的4.44倍；当浓度超过150 μmol/L后，其促进作用又开始下降，因此MJ最佳添加浓度为150 μmol/L。

由图4可以看出，与对照相比，所有添加物处理都达到了极显著差异且大部分处理之间都达到了极显著差异（P<001），添加物处理的促进作用随着浓度的升高呈现出先上升后下降的规律变化，当MJ添加浓度为150 μmol/L时，不定芽中可溶性糖含量达到最高值（7.69 mg/g，FW），比对照极显著提高4919%（P<0.01）。

2.2 不同刺激剂对百里香不定芽中SOD、POD、PPO、PAL活性的影响

2.2.1 苯丙氨酸对百里香不定芽中SOD、POD活性的影响由图5可以看出，添加一定浓度Phe后，诱导了SOD活性增强，随着浓度的升高，SOD活性表现为先增强后减弱的变化趋势，存在1个最佳浓度100 mg/L，其值高达 723.12 U/（g·min），约为对照的1.09倍。当Phe浓度超过100 mg/L时，其促进作用随着浓度的升高而下降；当浓度为 250 mg/L 时，SOD活性明显减弱，且显著弱于对照（P<001），说明高浓度的Phe抑制了不定芽中SOD活性，使不定芽的抗氧化能力下降。

由图6可以看出，所有添加物处理均不同程度地提高了不定芽中POD活性，与对照相比都达到了显著差异。随着Phe浓度的上升，POD活性的变化与SOD活性变化相似，也呈现出先增强后减弱的趋势。当添加浓度为100 mg/L时，POD活性最强，达到87.60 U/（g·min），约为对照的2.87倍。说明添加Phe后改善了植株的生理代谢，增强了POD活性，在一定程度上抑制了细胞因膜脂过氧化作用而引起的伤害。

2.2.2 苯丙氨酸对百里香不定芽中PPO、PAL活性的影响由图7可以看出，不同浓度的Phe对PPO的影响具有明显的差异，随着Phe浓度的升高，PPO活性呈现出先下降后上升的变化趋势。在50～200 mg/L的浓度范围内，PPO的活性极显著低于对照，其中100 mg/L Phe处理的PPO活性最弱，为194 U/（g·min），比对照极显著降低了53.76%（P<0.01），说明添加适宜浓度的Phe后有效缓解了不定芽在生长后期的褐化现象。但当浓度增加至250 mg/L时，其PPO活性迅速增强，并且高于对照，说明高浓度的Phe能诱导PPO活性增强，使得不定芽褐化加重。

由图8可以看出，在不同浓度的Phe处理下，PAL活性极显著强于对照，说明Phe的添加诱导了PAL活性的增强，从而有利于不定芽次生代谢物质的合成和积累。随着Phe浓度的升高，PAL活性的变化趋势与PPO活性的变化趋势相反，PAL活性表现为先增强后减弱的趋势，存在一个最佳浓度（100 mg/L），其PAL活性高达14.92 U，极显著高于其他处理，约为对照的9.62倍。

2.2.3 茉莉酸甲酯对百里香不定芽中S0D、POD活性的影响由图9可以看出，就浓度效应来看，低浓度MJ极显著地提高了不定芽中SOD活性，但高浓度MJ（250 μmol/L）却也极显著地抑制了SOD活性，MJ对SOD活性增强存在一个最佳浓度，即150 μmol/L，其SOD活性高达725.49 U/（g·min），约为对照的1.09倍。

由图10可以看出，添加不同浓度的MJ后都不同程度地增强了不定芽中的POD活性，其中50～200 μmol/L浓度处理显著高于对照处理（P<0.05），其中150 μmol/L MJ处理的POD活性最高，比对照显著增强40.55%。 250 μmol/L MJ处理与对照差异不显著。

2.2.4 茉莉酸甲酯对百里香不定芽中PPO、PAL活性的影响

由图11可以看出，在50～200 μmol/L浓度范围内，PPO活性极显著地低于对照，说明MJ的添加诱导了PPO活性的降低，从而可以缓解不定芽的褐化，延长不定芽的生长期。当MJ的浓度为150 μmol/L，其PPO活性极显著低于其他处理；当继续增加MJ浓度，PPO活性又开始上升，当浓度增加到 250 μmol/L 时，PPO活性显著高于对照，说明高浓度MJ可能使不定芽的褐化程度加重。

由图12可以看出，当添加MJ后，显著增强了不定芽的中PAL活性，促进了不定芽次生代谢的发生。在50～150 μmol/L 浓度范围内，PAL活性随着MJ浓度的升高而增强；但在150～250 μmol/L浓度范围内，PAL活性随着MJ浓度的升高而降低，说明150 μmol/L为MJ的最佳添加量，其PAL活性最强，高达9.33 U/（g·min），约为对照的1472倍。

综上可知，当添加Phe、MJ浓度分别为100 mg/L、150 μmol/L 时，无论是不定芽的生物量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量还是代谢途径中的各种酶活性都达到最佳水平，因此确定Phe、MJ调控百里香不定芽代谢的最适浓度分别为100 mg/L、150 μmol/L。

2.3 不同刺激剂对百里香精油提取率的影响

本试验进一步研究了最佳添加浓度的100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ对百里香精油提取率的影响。其中，添加 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ、未添加任何物质的百里香不定芽中百里香精油的提取率分别为0.42%、0.39%、0.31%，所得精油均含有松油味以及特殊香气，颜色无明显差别，均为金黄色，且经GC-MS联用仪分析，3种样品精油均含有百里香酚、香芹酚、对伞花烃、石竹烯等百里香精油的主要化学成分。可见，经100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ处理后促进了百里香不定芽精油的合成，其提取率分别比对照高355%、25.8%。

3 结论与讨论

近年来，随着植物组织和细胞培养技术的快速发展，关于如何利用刺激剂来协迫植物细胞合成和积累次生代谢物已成为生物学家研究的热点[13]。很多研究已经证明，生物的和非生物的刺激剂能有效调节次生代谢途径，促进目标次生代谢产物的高水平合成。如在甘草悬浮培养体系中添加10 mg/L水杨酸可以显著提高甘草总黄酮的含量[14]；徐立新等报道，在人参毛状根培养基中添加0.001 mmol/L茉莉酸甲酯可以促进人参皂苷的积累[15]；翟雪霞等发现，在培养基中加入 10 mg/L 苯丙氨酸，不仅可以明显促进红豆杉愈伤组织的生长，并且能显著提高紫杉醇含量，使其值高达 0.224%[16]。本试验结果表明，添加50～250 mg/L苯丙氨酸和50～250 μmol/L 茉莉酸甲酯都能提高百里香不定芽的增殖系数，促进生物量的大量积累，为植株进行次生代谢奠定物质基础。

刺激剂的添加不仅使细胞积极合成了植物防卫的次生代谢物质，如植保素、木质素等，同时也启动或加强了特定的次生代谢途径，从而引起细胞的代谢变化，而这些代谢过程的发生主要是通过酶类的调控来实现的，蛋白质含量的变化恰好反映了这些酶类的量变过程，其含量的高低可间接反映各种代谢活动的强弱[17]。王军妮在桑树试管苗培养时加入刺激剂Phe后，蛋白质的含量发生了明显的变化：桑叶中可溶性蛋白含量随苯丙氨酸浓度的升高而升高[18]。本试验结果显示，添加不同浓度的Phe、MJ后都不同程度地促进了百里香不定芽中可溶性蛋白质的含量，以100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ为最佳添加浓度，说明添加Phe、MJ后增强了百里香不定芽中各种代谢活动，促进了次生代谢产物的合成和积累。

糖类是影响植物组织培养成功与否的关键因素之一，糖的种类和用量不仅影响培养物生长量和生长速度，并且影响其代谢水平和次生代谢产物的合成[18]。本试验结果表明，在适宜浓度的Phe、MJ刺激下，百里香不定芽中的可溶性糖含量显著升高，使不定芽因碳源充足而快速生长；同时，可溶性糖还具有渗透调节的作用，从而影响不定芽次生代谢产物的合成。

已有研究证明，刺激剂加入到细胞培养体系后，大量自由基的产生诱发了自由基防御体系中酶保护系统的显著变化，以实现对细胞自身的保护[13]。本试验结果显示，添加适宜浓度的Phe、MJ能使不定芽SOD、POD活性显著增强，其中 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ效果最佳，说明添加这2种刺激剂有利于酶活性的表达，可以减轻活性氧积累，提高保护酶活性，使不定芽表现出更强的抗氧化能力，有效缓解各种胁迫对植物不利的影响，维持其正常的生理代谢功能。

PAL存在于所有绿色植物中，是苯丙烷代谢途径的关键酶，催化L-苯丙氨酸解氨生成反式肉桂酸[19]，程小萍等研究发现，酵母寡聚糖刺激剂可促进丹参细胞内PAL活性的增强，有利于丹参酮等次生代谢产物的合成[20]。严文文等也报道，在含有CoCl2的MS培养基中添加茉莉酸甲酯可以提高烟草愈伤组织中的PAL活性[21]。本试验结果表明，与CK相比，添加适量Phe、MJ后，能增强百里香不定芽中的PAL活性，且随着浓度的上升，其活性增强的幅度在上升，其中 100 mg/L Phe、150 μmol/L MJ 处理的PAL活性分别达到1492、9.33 U/（g·min），极显著高于其他处理，说明适宜浓度的Phe、MJ改善了百里香不定芽的生理代谢，促进了其次生代谢产物的积累。

百里香作为重要的芳香植物，其精油的应用价值高，但是目前关于离体培养条件下如何提高其精油含量的研究甚少。本试验通过苯丙氨酸、茉莉酸甲酯2种刺激剂对百里香不定芽生长增殖，不定芽中SOD、POD、PPO、PAL活性以及可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响，筛选出最佳苯丙氨酸（100 mg/L）、茉莉酸甲酯（150 μmol/L）的添加浓度，在此基础上，进行精油的提取，其精油得率有所提高，分别比对照高35.5%、25.8%，且精油的质量良好，其主要化学成分没有变化，均含有百里香酚、香芹酚、对伞花烃、石竹烯等百里香精油的主要化学成分，这为进一步调控百里香次生代谢途径、提高精油含量打下了一定的基础。

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