长链非编码RNA LOC653786诱导肺癌细胞抵抗吉西他滨的信号机制研究

徐俊燕，刘 峰，项 艳

0 引言

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，严重威胁着患者的身心健康[1]。由于肺癌早期症状不明显，多数患者一经发现已经是中晚期[2]。随着医药卫生事业的发展，当前肺癌的治疗方法已经不局限于手术、化学治疗和放射治疗，还增加了靶向治疗、免疫治疗、消融治疗等[3]。其中化学治疗仍然是肺癌治疗的主要方法之一，但获得性耐药的出现最终往往导致化学药物治疗失败[4]。因此，如何攻克获得性耐药是临床面临的严峻挑战。

吉西他滨为嘧啶类抗肿瘤药物，主要通过抑制DNA合成，抑制细胞从G1期向S期转化，最终抑制肿瘤细胞生长[5]。目前，吉西他滨在临床上可应用于治疗中晚期非小细胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌等实体肿瘤[6]。由于吉西他滨具有广谱抗肿瘤活性，在卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌及肾细胞癌的临床治疗中也具有一定疗效[7]。但应用一段时间后，肿瘤患者最终会对吉西他滨耐药。而目前还没有较好的方案解决吉西他滨耐药，因此，需要更多的基础理论依据为其提供支持。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一类非编码RNA，长度一般为200～100 000 nt[8]。近年来研究显示，lncRNA在多种疾病的发生发展中发挥重要作用，如冠心病、糖尿病及恶性肿瘤等[9]。LncRNA LOC653786是lncRNA大家族的一员，研究显示，LOC653786能调节肾细胞癌的增殖和周期进展[10]。本研究通过构建吉西他滨耐药肺癌细胞，观察LncRNA LOC653786 在其中的作用，并对其信号机制进行研究，为临床解决肺癌耐药提供基础理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌A549细胞(南京科佰生物科技有限公司)；吉西他滨和二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Sigma Aldrich公司)；总蛋白提取试剂盒和蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)；MTT粉末(上海碧云天公司)；磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer solution，PBS)(美国Hyclone公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)和DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)；LncRNA LOC653786和FOXM1小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)转染试剂盒(上海吉玛公司)；叉头框转录因子M1(Forkhead frame transcription factor M1，FOXM1)抗体、多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance associated protein1，MRP1)抗体和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抗体(美国Santa Cruz公司)；GAPDH抗体和抗鼠IgG，HRP二抗(上海爱必信公司)。ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；Multiskan FC 酶标仪和EVOS M5000倒置显微镜(美国ThermoFisher公司)；OptimaTMXPN超速离心机(美国贝克曼公司产品)；AI600凝胶成像仪(美国GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物配制 A549细胞培养体系为10% FBS、1%青霉素-链霉素和89% DMEM高糖培养基(即下文全培养基)。细胞培养环境为恒温37 ℃、5% CO2及95%空气的培养箱。吉西他滨以DMSO溶解，配制成200 μmol/L母液，分装冻存于-80 ℃备用。

1.2.2 A549/GR细胞的构建 A549细胞生长至对数期后，以含有10 μmol/L吉西他滨全培养基培养并传代2次，而后更换为正常全培养基并传代2次。通过逐步增加吉西他滨浓度(每次增加10～30 μmol/L)重复进行上述操作，最终获得一株耐药细胞A549/GR。通过MTT法计算A549/GR细胞耐药指数。

1.2.3 MTT 检测细胞增殖能力 将所需细胞培养至对数期，以9×103个/孔传代至96孔板中。次日，加入含梯度浓度(10、20、40、80、160和320 μmol/L)吉西他滨的全培养基150 μl处理48 h，同时以等量DMSO处理细胞作为对照组。处理结束后，每孔加入15 μl MTT，置于培养箱继续培养4 h。4 h后弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO，敲打培养板侧壁30 s。在A490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.4 RT-qPCR法检测细胞中LOC653786相对表达水平 所需细胞培养至对数期后，以Trizol法提取总RNA。于酶标仪上检测总RNA浓度，将总RNA稀释至500 ng/μl。采用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，于酶标仪上检测cDNA浓度。稀释LOC653786和内参GAPDH引物，按RT-qPCR试剂盒说明书依次加入引物、cDNA和反应试剂，进行RT-qPCR检测。反应条件为95 ℃ 10 min 1个循环，95 ℃ 2s、60 ℃ 30s、70 ℃ 5s 40个循环。LOC653786正向引物：GGAAAAGGCAACAGATGTCCA，LOC653786 反向引物：GGAAGCTGCTTGCAGAAGGAT；GAPDH正向引物：TGTGGGCATCAATGGATTTGG，GAPDH反向引物：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。

1.2.5 siRNA转染沉默LOC653786或FOXM1表达 将A549/GR 细胞分别设为未转染组(Control)、转染对照组(NC)和LOC653786沉默组(LOC653786 si)。将对数期A549/GR 细胞以5×105接种于6孔板中。次日按试剂盒说明书制备Lipofectamine 2000和siRNA混合液(LOC653786 siRNA和对照siRNA)静置10 min。LOC653786 si组以Lipofectamine 2000和LOC653786 siRNA(60 pmol/ml)处理，NC组以Lipofectamine 2000和对照siRNA处理(60 pmol/ml)处理，Control组以等体积培养基处理。转染24 h后更换全培养基。以荧光显微镜观察siRNA进入细胞情况，RT-qPCR验证LOC653786沉默效果。

将A549/GR 细胞分别设为未转染组(Control)、转染对照组(NC)和FOXM1沉默组(FOXM1 si)。按上文转染步骤进行转染操作。以荧光显微镜观察siRNA进入细胞情况，蛋白印记实验验证FOXM1沉默效果。

1.2.6 蛋白印迹检测蛋白表达 细胞按要求处理后,采用RIPA裂解液(含1 mM蛋白酶抑制剂)提取总蛋白。总蛋白通过BCA蛋白定量试剂盒进行定量，并以蛋白上样缓冲液制备含3 μg/μl总蛋白的蛋白样品。通过SDS-PAGE电泳将蛋白样品中不同分子量的蛋白分离，而后将蛋白从凝胶转印至PVDF膜上。将载有蛋白质的PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭4 h。裁剪PVDF膜，将对应膜以FOXM1抗体(1∶500)、MRP1抗体(1∶1 000)或P-gp抗体(1∶1 000)在4 ℃ 孵育过夜。次日TBST洗膜后加入抗鼠IgG，HRP二抗(1∶4 000)孵育1 h，TBST洗膜后，以ECL化学发光试剂盒在AI600凝胶成像仪下成像，对蛋白条带进行处理和分析。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 将处理好的细胞收集于5 ml离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。3 ml PBS吹打细胞，1 200 r/min离心5 min，弃去培养液，加入500 μl Binding Buffer重悬细胞。各加入5 μl Annexin V-FITC混匀，再加入5 μl PI混匀。室温避光孵育10 min,于流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

2 结果

2.1 A549/GR细胞对吉西他滨的耐药检测 MTT结果显示，与A549细胞相比，10、20、40、80、160和320 μmol/L吉西他滨对A549/GR细胞的抑制率均显著下降(P<0.05或P<0.01)，见表1。吉西他滨对A549和A549/GR细胞的IC50分别为32.3 μmol/L和192.3 μmol/L，A549/GR的耐药指数为6.0。

表1 吉西他滨对A549和A549/GR细胞增殖能力的影响

2.2 LncRNA LOC653786在A549/GR细胞中表达上调 RT-qPCR检测结果显示，相较于A549细胞，A549/GR细胞LncRNA LOC653786表达水平显著上调(P<0.01)，见图1。

图1 A549和A549/GR细胞LncRNA LOC653786表达水平注：**与A549细胞比较，P<0.01

2.3 FOXM1、MRP1和P-gp蛋白在A549/GR细胞中表达上调 蛋白印记结果显示，与A549细胞相比，A549/GR细胞FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达均明显上调(P<0.01)。见图2。

图2 A549和A549/GR细胞中FOXM1、MRP1和

2.4 沉默LOC653786表达抑制A549/GR细胞FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达上调 NC组和LOC653786 si组A549/GR细胞转染后均显示绿色荧光，见图3A。与NC组相比，LOC653786 si组LOC653786表达显著降低(P<0.01)，见图3B。蛋白印记结果显示，相较于NC组，LOC653786 si组FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达均显著下调(P<0.01)，见图3C-3D。

图3 沉默LOC653786表达对A549/GR细胞MRP1和P-gp蛋白表达的影响注：**与 NC 组比较，P<0.01

2.5 沉默FOXM1抑制A549/GR细胞MRP1和P-gp蛋白表达上调 转染法沉默A549/GR细胞FOXM1蛋白表达，如图4所示，NC组和FOXM1 si组成功进行转染，均显示绿色荧光。蛋白印记结果显示，与NC组相比，FOXM1 si组FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表达均明显下调。RT-qPCR结果显示，NC组和FOXM1 si组LOC653786表达无明显差异。

图4 沉默FOXM1对A549/GR细胞MRP1和P-gp蛋白以及LOC653786表达的影响注：**与NC组比较，P<0.01

2.6 各组A549/GR细胞对吉西他滨的敏感性 流式细胞仪结果显示，吉西他滨处理能一定程度诱导NC组细胞凋亡，但作用并不明显。而沉默LOC653786或FOXM1后，吉西他滨均能明显诱导细胞凋亡增加(P<0.01)见图5A-C。

3 讨论

早期研究认为，LncRNA是基因组转录的副产物，不具备生物学作用[11]。但近年来研究发现，LncRNA广泛参与染色质修饰、转录激活、转录干扰等多种生物学调控，并且在心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病中发挥一定作用[12-13]。越来越多的研究显示，LncRNA在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关[14]。一些LncRNA还参与恶性肿瘤的耐药形成[15]。本研究构建了吉西他滨耐药肺癌细胞A549/GR，耐药指数为6.0。分子水平上发现，A549/GR细胞MRP1和P-gp蛋白表达显著上调。研究报道，MRP1和P-gp蛋白能够介导耐药，并在多种耐药肿瘤中表达升高[16]。本研究发现，相较A549细胞，A549/GR细胞LncRNA LOC653786表达明显上调。提示LOC653786可能与A549/GR细胞吉西他滨耐药有关。本研究还发现，FOXM1蛋白表达在A549/GR细胞中显著上调。FOXM1是调控有丝分裂进程的重要的细胞周期转录因子,在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用[17]。研究显示，LncRNA LOC653786可通过FOXM1蛋白介导肾细胞癌细胞增殖[10]。提示FOXM1是LncRNA LOC653786的下游信号靶点。还有研究显示，FOXM1参与胶质瘤、骨肉瘤等恶性肿瘤的化疗耐药[18-19]。这些提示在本研究中，LncRNA LOC653786可能通过FOXM1蛋白介导MRP1和P-gp蛋白表达，从而促进A549/GR细胞吉西他滨耐药。

为进一步验证，本研究采用siRNA干扰技术干扰LncRNA LOC653786表达。结果发现，干扰LOC653786表达能明显下调A549/GR细胞FOXM1蛋白表达，提示LncRNA LOC653786能介导FOXM1蛋白表达。本研究还发现，干扰LncRNA LOC653786或FOXM1表达均可下调A549/GR细胞MRP1和P-gp蛋白表达，提示在A549/GR细胞中，高水平的LncRNA LOC653786可通过上调FOXM1蛋白表达而介导MRP1和P-gp蛋白表达升高。通过流式细胞仪检测吉西他滨对A549/GR细胞凋亡的诱导发现，干扰LncRNA LOC653786或FOXM1表达均可增强吉西他滨诱导的A549/GR细胞凋亡。

综上所述，LncRNA LOC653786与肺癌细胞吉西他滨耐药有关。LncRNA LOC653786能介导FOXM1蛋白表达，从而诱导MRP1和P-gp蛋白表达上调，最终参与吉西他滨耐药。本研究揭示了LncRNA LOC653786介导肺癌细胞耐药的潜在机制，可为临床治疗肺癌耐药提供理论依据。但LOC653786在肺癌细胞中的生物学作用及相关机制尚不明确，有待于进一步研究。