虎杖解毒颗粒(无糖型)改制前后指纹图谱对比研究

白雨鑫，李晋齐，童荣生

0 引言

中药指纹图谱研究技术以复方制剂整体为研究对象，展示制剂品质的真实性、一致性和稳定性，全面评价制剂中复杂的化学成分和比例，已成为国际公认的中药材和各制剂质量控制手段[1-2]。虎杖解毒颗粒(无糖型)是在保证原虎杖解毒颗粒处方、提取以及精制工艺不变的情况下，对成型工艺改制而得。为评价改制前后质量的变化，本研究对这两种制剂分别建立指纹图谱，并比较其共有峰及共有图谱模式的差异。

1 试验材料

1.1 药物与试剂 虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒(四川省人民医院药学部制剂室，各10个不同批次)、大黄素(批号：110756-200110)、虎杖苷(批号：11575-200502)、射干苷(批号：111632-200501)，甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，试验用水为超纯水。

1.2 仪器 e2695型HPLC仪(包括Waters公司2998 PDA检测器，Empower3色谱工作站)；BP211D型电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Gemini 110A C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；检测波长300 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl；流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(见表1)；色谱记录时间为120 min[3-4]。

表1 流动相梯度表

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 取虎杖苷、射干苷、大黄素对照品适量，各精密称定后置于50 ml容量瓶中，甲醇超声溶解，放冷定容，摇匀得虎杖苷8.83 μg/ml、射干苷15.15 μg/ml、大黄素7.28 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取研细并过三号筛的虎杖解毒颗粒(无糖型)粉末近5 mg，精密称定，转移至50 ml棕色容量瓶中，加入40 ml甲醇,超声溶解60 min，放至室温后定容摇匀，用0.45 μm有机系微孔滤膜滤过5 ml，取续滤液，即得。同法制备虎杖解毒颗粒供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 重复性试验 以编号S1的同一供试品为对象，按照“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样10 μl测定。以7号峰(虎杖苷)为参照，计算出各共有指纹峰的相对保留时间RSD范围(0.28%～0.62%)和相对峰面积RSD范围(0.59%～2.13%)，表明建立的方法重复性良好。

2.3.2 稳定性试验 取制备的供试品(编号S1)溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、12、24 h进样10 μl，以7号峰(虎杖苷)为参照，计算出各共有指纹峰的相对保留时间RSD范围(0.27%～0.79%)和相对峰面积RSD范围(0.46%～2.07%)，表明该方法制得的溶液稳定性良好。

2.3.3 精密度试验 取制备的供试品(编号S1)溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，每次10 μl，分析图谱。以7号峰(虎杖苷)为参照，计算出各共有指纹峰的相对保留时间RSD范围(0.16%～0.57%)和相对峰面积RSD范围(0.37%～1.83%)，表明仪器精密度良好。

2.4 指纹图谱的建立与分析

2.4.1 指纹图谱的重叠匹配 取10批虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒样品，以“2.2.2”项下方法处理，“2.1”项下色谱条件测定。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)导入数据，分析得到两种制剂样品的指纹图谱重叠匹配图[5]，结果见图1、图2。

图1 虎杖解毒颗粒(无糖型)的指纹重叠色谱图

图2 虎杖解毒颗粒的指纹重叠色谱图

2.4.2 共有峰的标定和参照峰的确认 利用多点校正进行自动匹配，中位数法生成对照图谱，共标定了19个峰形较好、稳定出现的共有峰。其中7号峰吸收强，峰面积大且保留时间稳定，故将其作为参照峰。

2.4.3 特征成分的指认 精密吸取虎杖解毒颗粒(无糖型)、虎杖解毒颗粒和混合对照品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样分析，色谱图匹配后见图3。通过与对照品图谱比对，指认两种供试品溶液的特征共有峰，分别为虎杖苷、射干苷和大黄素，7号参照峰为虎杖苷。

图3 虎杖解毒颗粒、虎杖解毒颗粒(无糖型)和混合对照品匹配色谱

2.4.4 虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒的共有模式比较 利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，得到两种供试品制剂的指纹图谱共有模式，如图4所示。

图4 虎杖解毒颗粒和虎杖解毒颗粒(无糖型)共有模式注：7.虎杖苷；9.射干苷；17.大黄素

2.5 指纹图谱的相似度分析

2.5.1 指纹图谱中共有峰的相对保留时间和相对峰面积 以参照峰(峰7)的保留时间和色谱峰面积为1.000 0，分别计算虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒中共有峰(1～19号峰)的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2～表5。

表2 虎杖解毒颗粒(无糖型)共有峰的相对峰面积

表3 虎杖解毒颗粒(无糖型)共有峰的相对保留时间

表4 虎杖解毒颗粒共有峰的相对峰面积

表5 虎杖解毒颗粒共有峰的相对保留时间

由表2～表5可知，在10个不同批次的虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒的指纹图谱中，共有峰的相对保留时间RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于5%，表明2种制剂的工艺均稳定可行，指纹图谱适应性良好。

2.5.2 指纹图谱的相似度计算 将各10批供试品的色谱图数据以AIA.格式导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)，进行相似度评价[6]。结果10批虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒指纹图谱的相似度平均值分别为 0.998和0.997，RSD值分别为0.32%和0.46%，符合指纹图谱测定要求，表明2种供试品制剂的各批次间差异较小，质量稳定性较好。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化 由于复方中药制剂成分复杂，在一个波长下难以体现所有成分的特征，本研究在供试品溶液全波长扫描基础上，重点考察250、300、360 nm波长切换扫描，结果显示，在300 nm条件下，检测到的色谱峰信息更全面，基线更平稳，故作为检测波长[7-9]。

参考相关文献对虎杖等药材中相关成分的色谱条件研究[10-11]，考察了不同提取溶剂(乙醇、水、甲醇)、不同柱温(30、35、40 ℃)、不同超声时间(30、60、90 min)、不同流动相体系(乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液)对色谱结果的影响。结果表明，用甲醇超声处理60 min，柱温30 ℃，流动相乙腈-0.05%磷酸溶液，各色谱峰分离情况及峰形较好。由于供试液成分在图谱前段重叠多、分离情况差，故对流动相前20 min降速，之后保持1 ml/min梯度洗脱。供试液中成分均在120 min前出峰，之后没有相关色谱峰出现，故进样时间定120 min。

3.2 虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒的图谱分析和对照 虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒各批次的指纹图谱相似度均大于0.98，说明创建的指纹图谱的技术指标稳定可靠、重复性较好，能够较好地全面反映制剂中化学成分的特征，并监控其成分及含量的变化。

对虎杖解毒颗粒(无糖型)和虎杖解毒颗粒指纹图谱共有模式进行对照，其19个共有色谱峰的相对保留时间基本一致。结果表明，两制剂的主要成分基本无变化，本研究为虎杖解毒颗粒(无糖型)研发的科学性、合理性提供了依据。