吉西他滨联合卡铂诱导NK/T细胞淋巴瘤细胞株凋亡的研究

阮涛，吴莉，刘岐焕，王季石

(1.贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002；2.湖北医药学院附属东风医院，湖北 十堰 442008；3.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004)

NK/T细胞淋巴瘤(NKTL)是血液及淋巴系统的恶性肿瘤之一，是一种特殊且具有高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，进展迅速且恶性程度极高[1]。在2016年WHO恶性淋巴瘤的分类标准中，NK/T细胞淋巴瘤被命名为结外NK/T细胞淋巴瘤(ENKTL)。目前研究显示[2-3]，以门冬酰胺酶(L-ASP)为基础的化疗方案[如甲氨蝶呤+异环磷酰胺+左旋门冬酰胺酶+依托泊苷(SMILE)方案]用于进展期ENKTL患者效果较好，其近期疗效以及远期的生存率均优于传统的环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松(CHOP)方案；含培门冬酶的方案[如吉西他滨+奥沙利铂+培门冬酶(P-Gemox)方案]对于Ⅲ/Ⅳ期及难治复发的ENKTL疗效较好，安全性较高[4]。也有报道[5-6]显示，以吉西他滨(GEM)为基础的方案，尤其是GDP(顺铂、吉西他滨、地塞米松)方案，患者耐受性可，能够取得较好疗效。2016年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南[7]和2018年淋巴瘤诊疗规范中均推荐GDP方案作为晚期ENKTL的一线治疗方案。GDP方案主要是吉西他滨、顺铂、地塞米松三种药物组合的化疗方案。吉西他滨为细胞周期特异性的脱氧胞苷类似物，作用在DNA的合成期(S期)；顺铂(DDP)为首个铂类药物，是一种广谱且高效抗癌药，但易造成一系列的毒性反应，其中肾毒性最为严重[8]。卡铂(CBP)为二代铂类，其与顺铂均为细胞周期的非特异性药物，非血液系统毒性(如耳、肾、神经毒性)较DDP低。目前国内外对卡铂的研究不断增加，在一些实体肿瘤中其抗肿瘤活性与顺铂相当，预测其在临床化疗中可能会有更大的空间[9-11]。目前吉西他滨联合卡铂用于治疗ENKTL的研究未见类似报道，因此本实验以卡铂替换顺铂，旨在探讨吉西他滨联合卡铂对ENKTL细胞株SNK 6细胞增殖的影响及可能的作用机制，为寻找低毒、高效的ENKTL化疗方案提供一定的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

NK/T细胞淋巴瘤细胞株(SNK 6)为本课题组长期保存；吉西他滨购于豪森药业有限公司，卡铂、顺铂购于齐鲁制药科技公司；RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购于Hyclone公司，二甲基亚砜(DMSO)购于北京索宝莱公司；细胞增殖-毒性检测法(CCK-8)试剂盒购于日本同仁研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购于碧云天生物技术研究所；BCA蛋白定量、PVDF膜试剂购于碧云天生物技术研究所；一抗[甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，Cleaved-Caspase-3、B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]和二抗(羊抗兔)购于CST公司。

1.2 细胞培养

从液氮瓶中快速取出实验用的细胞(SNK 6细胞)，将细胞重悬并接种到25 mL培养瓶中，轻轻摇匀后转入5% CO2，37 ℃，湿度为95%的细胞培养箱中进行培养，使细胞均匀贴壁生长，隔天进行细胞换液，使用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2 次。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 实验分组

选取吉西他滨分别与卡铂和顺铂做联合实验，用金式公式计算其联合用药的Q值。金式公式：Q=Ea+b/(Ea+Eb-EaEb)。公式中的Ea为A药单用的抑制率，Eb为B药单用的抑制率，Ea+b为两药联合应用的抑制率。Q值>1.15表示两药联合具有协同作用，Q值为0.85～1.15提示两药联合具有相加作用，Q<0.85提示两药联合具有拮抗作用。按试验需求设置分组：空白对照组、吉西他滨组、吉西他滨+卡铂组、吉西他滨+顺铂组。采用流式细胞术和蛋白免疫印迹法(Western Bloting)检测细胞凋亡率与凋亡蛋白表达。

1.4 CCK-8法检测药物对SNK 6细胞增殖的影响

用移液器轻柔吹打收集的处于对数期的SNK 6细胞，制成单细胞悬液，调整浓度为5×103个/mL，以每孔100 μL悬液接种于96孔板，设5个复孔，按设定的药物浓度处理细胞，于培养箱中分别孵育48 h；培养结束后向各孔再轻柔加入10 μL CCK-8溶液，转入培养箱中再孵育4 h；而后采用酶标仪(450 nm)检测各孔的吸光度(OD值)，重复3次。根据OD值计算细胞抑制率，公式为：抑制率=(1-加药孔OD值/对照孔OD值)×100%。应用SPSS软件算出半数抑制浓度(IC50)。采用金氏公式判断吉西他滨与卡铂组和吉西他滨与顺铂组联合用药的性质。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测凋亡率

采用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测凋亡率。收集对数期生长的SNK 6细胞，于96孔板中缓慢加入细胞悬液，每孔2 mL，加入上述4组药物，转入培养箱中孵育48 h后收集细胞，离心5 min后倒去上层清液；用PBS洗涤SNK 6细胞2次，再次离心后弃掉上层液体收集沉淀；以1×Binding Buffer重悬细胞。分别向上述4组细胞悬液中逐滴缓慢加入5 μL Annexin V-FITC染液，冰上避光孵育15 min后，加10 μL碘化丙啶染色液(PI)混匀，避光且于4 ℃下孵育5 min；最后加400 μL 1×Binding Buffer；在60 min内用流式细胞仪检测。

1.6 蛋白免疫印迹法检测凋亡蛋白的表达

提取各组细胞的蛋白，通过电泳、转膜、洗膜、一抗4 ℃摇床孵育16 h、二抗室温孵育1 h、洗膜、在蛋白免疫印迹化学发光试剂盒(ECL)液中于凝胶成像系统下曝光，以GAPDH为内参照。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 三种药物单用对SNK 6细胞增殖的影响

根据药物终浓度(即药物在体内血浆峰浓度的1/10)的不同比例以及预实验(药物敏感实验)的结果来设定吉西他滨、卡铂、顺铂三种药物的不同浓度梯度，采用CCK-8法分别检测上述三种药物对SNK 6细胞的抑制作用，用细胞抑制率与剂量对数作图，并求出各自IC50值。结果提示：与空白对照组比较，不同浓度的吉西他滨、卡铂、顺铂作用于培养48 h的SNK 6细胞均有抑制作用，且随着药物浓度的增加，对SNK 6细胞的抑制作用也逐渐增强，呈剂量依赖效应，差异均有统计学意义(P<0.05)。吉西他滨、卡铂和顺铂的IC50分别为(0.001 7±0.000 3) μg/mL，(10.44±1.23) μg/mL，(5.75±0.51) μg/mL(见表1和图1)。

表1 不同浓度药物单用对SNK 6细胞的抑制率

图1 吉西他滨和卡铂及顺铂对SNK 6细胞的抑制率

2.2 吉西他滨联合卡铂或顺铂对SNK 6细胞增殖的影响

根据2.1结果，用不同浓度吉西他滨分别与顺铂和卡铂做联合实验，即0.000 1 μg/mL吉西他滨+5.75 μg/mL顺铂或10.44 μg/mL卡铂，以及0.001 7 μg/mL吉西他滨+5.75 μg/mL顺铂或10.44 μg/mL卡铂，通过计算出Q值判断吉西他滨与卡铂和吉西他滨与顺铂联合用药的性质。结果显示，在较低浓度吉西他滨(0.000 1 μg/mL)与卡铂和顺铂的联合用药中，吉西他滨+卡铂组和吉西他滨+顺铂组对SNK 6细胞的抑制率与吉西他滨相比明显增高(P<0.05)，两者联合为相加作用。吉西他滨+卡铂组对细胞的抑制率略低于吉西他滨+顺铂组，但差异无统计学意义(P>0.05)，说明其对SNK 6细胞抑制率相当，且两药联合仍为相加作用(见表2)。

2.3 吉西他滨联合卡铂或顺铂对SNK 6细胞凋亡的影响

2.3.1 细胞凋亡率检测

根据以上实验提示吉西他滨联合卡铂对SNK 6细胞有抑制作用，吉西他滨+卡铂与吉西他滨+顺铂对SNK 6细胞抑制作用相当，进一步检测其对SNK 6细胞凋亡的影响，结果显示：空白对照组、吉西他滨组、吉西他滨+卡铂组、吉西他滨+顺铂组凋亡率依次为：(4.39±1.06)%，(24.30±2.64)%，(47.11±1.98)%和(51.41±2.15)%。吉西他滨组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.05)，吉西他滨+卡铂组、吉西他滨+顺铂组均高于吉西他滨组和空白对照组(P<0.05)，而吉西他滨+卡铂组细胞凋亡率稍低于吉西他滨+顺铂组，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。

a为空白对照组；b为吉西他滨组；c为吉西他滨+卡铂组；d为吉西他滨+顺铂组；e为四组的凋亡率比较；*表示吉西他滨组和吉西他滨+卡铂组与空白对照组相比，P<0.05图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

2.3.2 凋亡相关蛋白检测结果

为了进一步探索吉西他滨联合卡铂诱导SNK 6细胞凋亡的可能机制，用Western Blotting法检测上述四组Cleaved-caspase-3，Bcl-2，Bax等凋亡蛋白的表达水平。结果显示：与空白对照组相比，吉西他滨可下调Bcl-2蛋白的表达水平，上调Cleaved-caspase-3蛋白、Bax蛋白的表达水平(P<0.05)。与吉西他滨组比较，吉西他滨与卡铂或顺铂联合时效果更加显著(P<0.05)，吉西他滨+顺铂组效果稍强于吉西他滨+卡铂组，但差异无统计学意义(P>0.05)(见图3)。

3 讨 论

ENKTL有其独特的生物学及临床表现，Ⅰ期/Ⅱ期ENKTL患者可考虑放疗或化疗联合治疗，Ⅲ/Ⅳ期可采用以L-ASP为基础的化疗和造血干细胞移植。目前GDP方案被推荐为治疗晚期ENKTL的一线方案。卡铂肾毒性较顺铂低，可替换顺铂用于许多癌症的化疗，但卡铂并不是在所有肿瘤中都具有类似顺铂的效应。目前吉西他滨联合卡铂用于治疗ENKTL的研究未见类似报道。因此，本实验以卡铂替换顺铂，采用CCK-8法、流式细胞术、Western Blotting法来探讨卡铂联合吉西他滨对SNK 6细胞的凋亡作用。本实验结果显示，随着药物浓度的不断增加，对SNK 6细胞的抑制率不断增强，有明显的剂量依赖效应。吉西他滨对SNK 6细胞抑制作用最强，与国外报道相一致[12-13]。本实验卡铂对SNK 6细胞的抑制作用低于顺铂。回顾性研究[14]表明，卡铂是不依赖耐药基因MDR-1的药物，对ENKTL有较好的效果，而在本研究中，卡铂单用对SNK 6细胞抑制效果低于顺铂，这可能与恶性肿瘤细胞在体内外生长存在特异性差异有关系。同时，卡铂以联羧基环丁烷取代顺铂结构中的氯离子配体，与DNA交联作用较为缓慢，是导致其药理作用和毒副作用差异的关键因素[15]。

#表示吉西他滨组与空白对照组相比，P<0.05；*表示吉西他滨+卡铂组和吉西他滨+顺铂组与吉西他滨组相比，P<0.05图3 Western Blotting检测各组凋亡相关蛋白相对表达结果

本研究结果显示，吉西他滨+卡铂组对细胞的抑制率略低于吉西他滨+顺铂组，但差异无统计学意义。在本实验联合用药中，卡铂、顺铂分别与吉西他滨联合，发现其对SNK 6细胞的抑制作用相当，这可能与吉西他滨和卡铂联合应用时具有相加作用有关。有报道显示[16]吉西他滨可通过促进DNA合成以及修复来加强卡铂的细胞毒性；卡铂同时能提高吉西他滨导致DNA链变性的作用，提示二者联合可以增强药物的疗效。同时有研究[17-19]显示，吉西他滨联合卡铂用于治疗宫颈癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌均有一定效果，但二者联合治疗ENKTL却未见类似报道。本实验采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术来检测凋亡率，其结果提示：吉西他滨联合卡铂或顺铂的凋亡率均高于吉西他滨组和空白对照组，而吉西他滨+卡铂组细胞凋亡率稍低于吉西他滨+顺铂组，但两组比较差异无统计学意义。该结果与CCK 8法结果一致，提示卡铂联合吉西他滨可诱导SNK 6细胞凋亡，且卡铂、顺铂分别与吉西他滨联合时对SNK 6细胞凋亡作用相当。有研究显示，吉西他滨可有效促进与Cleaved-Caspase-3相关的凋亡通路的激活，对特定蛋白底物水解进行有效抑制，从而诱导细胞凋亡[20]。本实验Western Blot结果提示：与空白对照组相比，吉西他滨通过下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，使Bax/Bc1-2升高，从而上调cleaved caspase-3蛋白的表达。吉西他滨与卡铂和顺铂联合时蛋白表达趋势更为显著，且吉西他滨+卡铂组稍低于吉西他滨+顺铂组，两组比较差异无统计学意义，从而推测吉西他滨、卡铂可能是通过线粒体途径促进SNK 6细胞发生凋亡。但细胞凋亡过程较为复杂，凋亡基因之间复杂的调控关系有待利用其他方法进一步研究。

综上，吉西他滨联合卡铂可诱导SNK 6细胞发生凋亡，其可能机制是通过线粒体途径发生凋亡，且一定浓度下的卡铂或顺铂联合吉西他滨对SNK 6增殖及凋亡作用相当。本实验提示：吉西他滨联合卡铂在一定浓度条件下或许可以替换吉西他滨联合顺铂用于ENKTL的化疗，尤其在因顺铂的肾毒性严重而无法使用顺铂时，卡铂与吉西他滨联用可能更具优势。但本实验不足之处在于细胞在体外培养的环境与肿瘤细胞的体内生长环境不完全相同，药物敏感实验仅反映部分肿瘤细胞的凋亡率，只能反映肿瘤生长的某一个阶段，并不能完全体现药物-人体-肿瘤的关系，有待后续进行相应的动物实验及临床实验深入探讨。