黄芪甲苷对阿霉素肾病小鼠的保护作用及机制研究

于晓霞，郑明楠，朴明姬，朱 虹，边 艳，韩 帅，吴 华，高弼虎

0 引言

肾病综合征是临床上常见的肾脏疾病，常表现为低蛋白血症、高脂血症、大量蛋白尿等[1]，若未及时治疗或治疗不当，病情可进展为重度水肿、感染、血栓形成、急性肾损伤等严重并发症，对患者正常生活及自身健康构成严重威胁，严重者会逐渐进展至终末期肾病[2]。因此，寻求有效的治疗措施已成为临床医师关注的热点。

肾病综合征的共同特点是足细胞损伤，目前体内及体外多项实验证实，中药黄芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)具有减轻足细胞损伤的作用[3-4]。因此，本研究通过球后静脉注射阿霉素(Adriamycin，ADR)的方法，建立经典的肾病综合征动物模型-阿霉素肾病(Adriamycin nephropathy，AN)小鼠模型[5]，并将中药黄芪甲苷作用于阿霉素肾病小鼠，观察其对小鼠尿蛋白、肾功能等生化指标的影响，并通过免疫组化技术检测肾组织足细胞Nephrin、Desmin蛋白的表达，初步观察黄芪甲苷对阿霉素肾病小鼠的保护作用，并探讨可能的机制，为临床治疗肾病综合征提供新的理论基础和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康无特定病原体(SPF)雄性BALB/c小鼠24只，体重(22.73±1.49)g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001。在大连大学附属中山医院动物实验中心饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2018-0005。小鼠采用抽签法随机分为3组：对照组(8只)、模型组(8只)和黄芪甲苷组(8只)。实验过程中动物自由摄食和饮水，动物实验均依据《医学实验动物管理实施细则》的要求，按照动物福利与伦理原则处理。

1.2 药物及试剂 阿霉素注射粉剂购自北京索莱宝科技有限公司，批号：D8740。异氟烷购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：B2028066。戊巴比妥钠购自美国Sigma公司，批号：P3761。尿白蛋白/肌酐(Albumin to creatinine，ACR)检测试剂盒购自南京建成有限公司，批号：20190722。牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司，批号：SA8130。兔抗小鼠Nephrin抗体(1∶1 000)购自Servicebio，批号：GB11081。兔抗小鼠Desmin抗体(1∶1 000)购自Servicebio，批号：GB11343。HRP山羊抗兔二抗(1∶200)购自Servicebio，批号：GB23302。DAB显色液购自Servicebio，批号：G1211。

1.3 仪器 全自动生化分析仪：日本Olympus公司 AUA640；光学显微镜：日本Olympus公司 CX41；低温离心机：德国Sigma公司(8K)；脱水机：武汉俊杰电子有限公司(JJ-12J)；包埋机：武汉俊杰电子有限公司(JB-P5)；病理切片机：上海徕卡仪器有限公司(RM2016)。

1.4 模型制备及给药 模型组：小鼠异氟烷吸入麻醉后，经眼球后静脉注射阿霉素(10 mg/kg)建立实验阿霉素肾病小鼠模型。造模后第1周测量小鼠ACR，如模型组与对照组相比，ACR差异有统计学意义(P<0.05)为造模成功。对照组：眼球后静脉注射与阿霉素同等剂量的生理盐水(10 ml/kg)。黄芪甲苷组：造模同模型组，造模后第2周开始，每日给予黄芪甲苷40 mg/(kg>·d)[3](用1%羧甲基纤维素钠溶解)灌胃，共治疗8周，对照组及模型组均给予含1%羧甲基纤维素钠的生理盐水灌胃。

1.5 小鼠尿白蛋白/肌酐检测 分别于小鼠造模前1 d(0周)及实验第1周、第10周末收集尿液，低速低温离心机中离心，去除沉渣，按试剂盒检测说明，采用ELISA法测定小鼠尿白蛋白和肌酐，计算ACR。

1.6 生化指标检测及方法 10周末，用3%戊巴比妥钠麻醉小鼠后心脏穿刺采血，血液标本置于含抗凝剂EDTA的离心管中，离心取上清置于-20 ℃冰箱保存，使用全自动生化分析仪进行血清总蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、肌酐(Serum creatinine，Scr)、总胆固醇(Total cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)的测定。

1.7 足细胞Nephrin、Desmin蛋白的检测 免疫组化法检测足细胞Nephrin、Desmin蛋白的表达：首先对所有切片进行脱蜡处理，切片经过抗原修复后，PBS 清洗 3 min，共3次；在切片的组织上滴加 3% H2O2，以灭活内源性过氧化物酶，室温避光放置 10 min；结束后 PBS 清洗3 min，共3次；按照抗体说明书稀释一抗，滴加适量一抗稀释液后，4 ℃冰箱孵育过夜。次日，PBS清洗3 min，共3次，按抗体说明书滴加二抗，室温孵育30 min；PBS 清洗3 min，共2次，DAB 显色30 s后，蒸馏水终止反应。然后进行苏木素衬染、盐酸酒精分化、氨水返蓝，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。每张片子随机选取10个肾小球，进行阳性细胞计数，计算平均值。

2 结果

2.1 小鼠的生存情况 小鼠于注射阿霉素1 d后，出现畏光、精神不振、毛质粗糙及脱毛、活动量减少、进食及饮水量下降，有不同程度的腹泻，1周后上述情况逐渐恢复。模型组小鼠于造模后第2天死亡1只；黄芪甲苷组小鼠于造模后第3周死亡1只。其余小鼠均健康存活。

2.2 各组小鼠体重比较 模型组及黄芪甲苷组小鼠注射阿霉素后，平均体重迅速下降，至第1周末降至最低，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。第2周开始两组小鼠体重均逐渐增长，但模型组小鼠于第2、4、6周末测量体重仍明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，黄芪甲苷组小鼠体重增长速度略快，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.3 黄芪甲苷对阿霉素肾病小鼠ACR的影响 各组小鼠造模前ACR差异无统计学意义(P>0.05)，造模后第1周末，模型组及黄芪甲苷组小鼠ACR较对照组明显升高(P<0.001)，提示造模成功。实验第10周末，与对照组相比，模型组小鼠ACR显著增加(P<0.01)；黄芪甲苷治疗后，小鼠ACR水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)。见图2。

图2 各组小鼠ACR比较注：*与对照组比较，P<0.001；#与模型组比较，P<0.001

2.4 黄芪甲苷对阿霉素肾病小鼠生化指标的影响 实验第10周末，与对照组比较，模型组小鼠TP、ALB明显降低，TC、TG、BUN及Scr均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪甲苷治疗组ALB水平显著升高(P<0.01)，TC、TG、BUN及Scr均显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组小鼠生化指标比较结果注：*与对照组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.05；##与模型组比较，P<0.01

2.5 黄芪甲苷对小鼠足细胞Nephrin、Desmin蛋白的影响 与对照组比较，模型组小鼠肾脏组织足细胞Nephrin的表达明显减少，Desmin蛋白的表达增多，差异有统计学意义(P<0.01)；经黄芪甲苷治疗后，Nephrin的表达较模型组显著上调，Desmin蛋白的表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、图5。

图4 各组小鼠足细胞Nephrin、Desmin蛋白的表达情况(400×)注：红色箭头为阳性表达细胞

图5 各组小鼠足细胞Nephrin、Desmin蛋白的表达情况注：*与对照组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.05

3 讨论

肾病综合征发病机制复杂，是一种常见的难以根治的肾脏疾病，其主要发病机制是肾小球基底膜通透性增加，导致肾小球滤过率降低，表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和水肿[6]。本研究采用眼球后静脉丛注射阿霉素的方法复制阿霉素肾病模型以模拟人类肾病综合征，结果显示，小鼠尿蛋白、血肌酐及血脂水平显著升高，血清白蛋白降低，证实成功建立了小鼠肾病综合征模型。文献报道，啮齿类动物注射阿霉素后，药物能迅速分布于肾脏组织引起肾损害[7]，主要机制：①阿霉素对足细胞有直接毒性作用，可导致足细胞相关蛋白分布以及细胞骨架发生紊乱，造成足细胞的形态学改变；②阿霉素含有醌式结构，可产生活性氧，诱发肾小球上皮细胞脂质过氧化反应，破坏肾小球滤过膜的完整性，导致膜滤过屏障病变而形成持续蛋白尿；③阿霉素能激活多种细胞因子及炎性介质，破坏肾脏固有细胞，促进系膜细胞增殖和系膜基质增多，诱导炎症反应，缓慢发展形成肾小球硬化[8-11]。

蛋白尿是促进慢性肾脏病向终末期肾脏病进展的独立危险因素，因此，控制蛋白尿是防治肾脏病进展的基础。我国的传统中药黄芪具有补气升阳、固表止汗、行水消肿和脱毒生肌等功效，自古广泛应用于肾脏病的治疗。孙成峰[12]对96例原发性肾病综合征患者进行观察，对照组患者口服强的松，观察组患者在口服同等剂量强的松的基础上联合黄芪注射液，连续治疗1个月后，两组患者的24 h尿蛋白定量均明显降低，血浆白蛋白明显增多，并且观察组患者上述各项指标改善效果均显著优于对照组。Zhang等[13]通过Meta分析研究了黄芪单体或其提取物对慢性肾脏病患者的治疗作用，发现黄芪能够有效降低患者肌酐清除率，提高血清白蛋白水平。上述结果提示，黄芪可明显改善原发性肾病综合征及慢性肾脏病患者的尿蛋白、血浆白蛋白等指标水平，具有肾脏保护作用。黄芪甲苷是黄芪最主要的药理活性成分之一，本研究中，给予阿霉素肾病小鼠黄芪甲苷治疗后，与模型组小鼠比较，治疗组小鼠的尿蛋白、血肌酐水平均显著降低，且血白蛋白水平显著升高，提示黄芪甲苷可有效降低阿霉素肾病小鼠的尿蛋白及血肌酐水平，升高血清白蛋白，发挥肾脏保护作用。

肾病综合征患者伴有严重的血脂代谢异常，常表现为胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平升高等，而高脂血症也是肾小球硬化发生发展的独立致病因素，对肾病综合征的进展有重要的影响，降脂治疗也具有改善蛋白尿的作用[14]。余伍中等[15]发现，黄芪能够通过增强脂蛋白酯酶与卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性，促进低密度脂蛋白的降解和胆固醇逆转运，从而降低血三酰甘油和胆固醇水平，上调低密度脂蛋白受体mRNA表达，促进三酰甘油、胆固醇降解而从循环中清除。本研究观察到黄芪甲苷可显著降低阿霉素肾病小鼠的三酰甘油及胆固醇水平，与文献报道一致。说明黄芪甲苷可通过降低阿霉素肾病小鼠的血脂水平发挥肾保护作用。

大量研究证实，蛋白尿的产生与肾脏足细胞的损伤密切相关。近年来，研究者先后确定了多个定位于足细胞的结构蛋白分子，如Nephrin、Desmin等，且均与蛋白尿的产生密切相关。在很多肾脏疾病中，足细胞上Nephrin和Desmin的表达失调早于足细胞超微结构病变和蛋白尿的发生[16]。研究认为，Nephrin表达下调和Desmin表达上调是足细胞损伤的标志[17-18]。在本研究中，模型组小鼠足细胞Nephrin表达明显下降，Desmin表达量升高，与文献报道一致；给予黄芪甲苷治疗可显著上调足细胞Nephrin表达，下调Desmin表达。证实黄芪甲苷可调控足细胞Nephrin和Desmin表达,从而减轻足细胞损伤，保护肾脏。

综上所述，黄芪甲苷可通过调节足细胞Nephrin和Desmin蛋白的表达，降低阿霉素肾病小鼠尿蛋白、血肌酐及血脂水平，提高血白蛋白水平，从而发挥肾脏保护作用。