小球藻不饱和脂肪酸碱提法工艺优化及其品质分析

李世洋 杨 阳 葛胜晗 林少玲

(福建农林大学食品科学学院，福州 350002)

功能性油脂是一类具有预防内源性疾病、抗衰老和抑癌等特殊生理功能的油脂，在传统食用油脂(如大豆油)中添加功能性油脂可以大大提升食用油的营养品质和保健功效，成为一种对人体更加有益的食用油，但功能性油脂目前存在产量低、成本高和油脂品质差等问题[1，2]。不饱和脂肪酸是功能性油脂中的主要活性物质，其中多不饱和脂肪酸具有降胆固醇、降血脂、改善老年痴呆等保健作用，对于调节人类生理功能有着非常重要的作用[3-5]。用不饱和脂肪酸替代功能性油脂添加到传统食用油中，可以起到与功能性油脂相同的作用，同时也能弥补功能性油脂的不足。而小球藻中富含蛋白、多糖、油脂等营养活性成分，其中多不饱和脂肪酸在小球藻油脂中质量分数达到70%以上，并且亚油酸和α-亚麻酸2种多不饱和脂肪酸质量分数分别高达47%、13%[6]。并且小球藻在自然界中分布较为广泛、生命力强、易于培养，所以在食品和医药等领域的应用有很广阔的前景[7，8]。

目前小球藻不饱和脂肪酸的提取方法主要有油脂水解法和碱提法等，油脂水解法需要先从小球藻中提取油脂，将油脂皂化水解后再萃取分离得到脂肪酸[9-11]，目前已有较多研究。油脂水解法中主要包括浸提法和超临界萃取法。其中浸提法所需提取周期较长，并且需要大量使用提取溶剂，常用的提取溶剂有生物基溶剂[乙酸乙酯、乳酸乙酯、环戊基甲醚(CPME)和2-甲基四氢呋喃等]和有机溶剂(正己烷、甲醇、石油醚、氯仿等及其混合溶剂体系)[12]。生物基提取溶剂的使用会在一定程度上降低提取物中不饱和脂肪酸的含量[13]，此外，由于大多数有机提取溶剂对人体有害，所以在食品工业中的应用中通常受到严格的管控。相较于浸提法，超临界CO2萃取法是一种更加绿色温和的提取方法，具有提取产品纯度高、毒副作用产物少等优点，但对提取条件和提取设备的要求较高[14，15]。与油脂水解法相比较，直接碱提法可以从小球藻中直接提取得到小球藻不饱和脂肪酸，能有效提高不饱和脂肪酸的提取效率，减少提取过程中提取溶剂的使用，节省提取时间，更好地避免不饱和脂肪酸的氧化，能大大提高经济性和实用性[16]，但目前对于小球藻不饱和脂肪酸直接碱提法研究较少。

本研究对小球藻不饱和脂肪酸的直接碱提法进行工艺优化以及对小球藻不饱和脂肪酸的品质进行研究，并分析在大豆油中添加不同浓度的小球藻不饱和脂肪酸后对大豆油油脂特性的影响。以期得到更加适宜的小球藻不饱和脂肪酸的提取方法，以及为小球藻不饱和脂肪酸在功能性油脂开发中的潜在应用前景提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 原料与试剂

小球藻干粉(喷雾干燥)、亚麻籽油标准品、大豆油；正己烷、尿素、甲醇、氢氧化钾、35%盐酸均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

电子天平，旋转蒸发器，多功能搅拌器、数显恒温水浴锅，高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 碱提法提取小球藻不饱和脂肪酸

小球藻不饱和脂肪酸的提取参考王玉仙[17]的方法，在其基础上稍作改动。称取 1 g 左右小球藻干藻粉于 1 L 的三角瓶中，向三角瓶中加入浓度为0.5 mol/L的KOH/甲醇溶液20 mL，60 ℃热水浴中加热搅拌 1 h得皂化液，抽滤分离除去藻体，滤液用盐酸将 pH 调成酸性后移入萃取分离器中，加入正己烷充分萃取，获得有机相，旋蒸除去正己烷溶剂得到小球藻混合脂肪酸。

60 ℃水浴加热配制0.2 g/mL尿素/甲醇溶液，称取一定量混合脂肪酸加入到配好的尿素溶液中后放置于4 ℃环境过夜。取出后用少量去离子水洗涤，而后迅速抽滤，然后再加入相同体积的正己烷进行充分萃取，萃取后正己烷相用滤液旋转蒸发进行浓缩即得富集后的小球藻不饱和脂肪酸样品。

提取完毕后，小球藻不饱和脂肪酸的得率按公式计算：

式中：m2为离心管与小球藻不饱和脂肪酸样品质量/g；m3为离心管空管质量/g。m1为小球藻干粉质量/g。

1.2.2 单因素实验

以小球藻不饱和脂肪酸的提取率为指标，控制提取料液比1∶20(g/mL)、提取时间、60 min不变，考察在提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃的条件下时小球藻不饱和脂肪酸得率的影响。

以小球藻不饱和脂肪酸的提取率为指标，控制提取时间60 min、提取温度60 ℃不变，考察在提取料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的条件下时对小球藻不饱和脂肪酸得率的影响。

以小球藻不饱和脂肪酸的提取率为指标，控制提取料液比1∶20(g/mL)、提取温度60 ℃不变，考察在提取时间分别为30、60、90、120、150 min的条件下时对小球藻不饱和脂肪酸得率的影响。

1.2.3 响应面法实验

在以提取料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)进行单因素实验的基础上，确定提取条件的最优范围后，将A、B、C作为考察因素，小球藻不饱和脂肪酸得率作为响应值，根据Box-Behnken设计三因素三水平的中心组合实验。响应面实验因素与水平见表1。

表1 中心组合实验因素与水平

1.2.4 气相色谱法分析小球藻不饱和脂肪酸成分

取小球藻不饱和脂肪酸样品3 mL，色谱条件：色谱柱采用HP-5MS 石英弹性毛细管柱，规格为30 m×0.25 mm×0.2 μm；溶剂：正己烷；载气：氦气(纯度为99.99%) ；流速1 mL /min，进样量1.0 μL，分流比20∶1；升温程序：柱子初始温度80 ℃，保持1.1 min，先以17 ℃/min 的升温速率升至240 ℃，维持0.7 min，然后再以1 ℃/min 的升温速率升至253 ℃，保持4 min；进样口温度253 ℃。质谱条件：离子源为电子轰击源(EI)，电离电压70 eV，四级杆温度150 ℃，EM 电压1 024 V，离子源温度230 ℃，质量扫描范围40～600 u。

取大豆油样品3 mL，分析条件：色谱柱用HP-88，规格为60 m×250 μm×0.2 μm；进样量1 μL；升温程序：柱子初始温度40 ℃保持在3 min，以40 ℃/min的升温速率升至120 ℃，再以8 ℃/min的升温速率升至160 ℃，持续1 min；以3 ℃/min的升温速率升至181 ℃，持续10 min；以2 ℃/min的升温速率升至212 ℃，持续5 min；共运行48.5 min。检测器为FID，汽化温度250 ℃，氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min，尾吹流量19.5 mL/min[18]。

1.2.5 小球藻不饱和脂肪酸油脂品质特性测定

空白对照组：纯大豆油。实验组：在大豆油中添加不同浓度的小球藻不饱和脂肪酸，添加小球藻不饱和脂肪酸的比例分别为25、50 mg/mL；标准品组：在大豆油中添加亚麻籽油，比例为100 mg/mL；将4个组别分别标记为：大豆油组(纯大豆油)、C.PUFA 1组(将小球藻不饱和脂肪酸按25 mg/mL的比例加入大豆油中)、C.PUFA 2组(将小球藻不饱和脂肪酸按50 mg/mL的比例加入大豆油中)和标品组(将亚麻籽油按100 mg/mL的比例加入大豆油中)。

1.2.5.1 酸价的测定

酸价采用优化的国标法进行检测。精确称取3～5 g样品将其放于锥形瓶中，加入50 mL乙醚-乙醇按比例2∶1混合的混合试剂，摇动锥形瓶使样品充分溶解，然后加3滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L碱液(KOH)滴定至出现微红色30 s不消失，记录消耗的碱液体积。按公式计算酸价：

式中：V为滴定中使用的碱液体积/mL；N为碱液的浓度；56.1为碱液的毫克当量；m试样的质量/g。

1.2.5.2 过氧化值的测定

过氧化值采用优化的国标法进行检测。精确称取样品2～5 g放到锥形瓶中，在锥形瓶中加入50 mL乙酸乙酯和冰乙酸按比例2∶3混合的混合溶剂，摇匀使样品完全溶解。然后加入0.5 mL饱和碘化钾溶液摇匀后避光放置3 min。立即加入30 mL蒸馏水摇匀，用硫代硫酸钠溶液滴定至黄色几乎消失。加入0.5 mL淀粉指示剂摇匀，再用硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失即为滴定终点。滴定过程中均需不断摇动。按公式计算过氧化值：

式中：c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度/mol/mL；0.126 9为每毫摩尔硫代硫酸钠相当于碘的克数；V1为试样液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积/mL；V0为空白溶液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积/mL；m为试样的质量/g。

1.2.6 数据分析

单因素实验数据使用Excel2010，GraphPad Prism 6软件进行处理，数据表示为平均值±标准差(Standard Deviation，SD)差异显著性分析使用SPSS软件进行，不同字母表示显著差异(P<0.05)，响应面法实验数据使用Design Expert 8.0.6 软件进行处理。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

在提取料液比为1∶20，提取温度为60 ℃的条件下，改变提时间分别为30、60、90、120、150 min，分析提取时间对小球藻不饱和脂肪酸得率的影响，结果如图1，提取时间对小球藻脂肪酸不饱和得率影响显著。在提取时间为30～60 min之间时，提取时间越长，小球藻不饱和脂肪酸得率越高；60 min之后，随着提取时间的增加，得率持续下降。这可能是由于在60 min之前，小球藻不饱和脂肪酸无法拥有足够的时间被溶出，而60 min之后，由于时间过长，会导致提取溶剂的部分蒸发损失导致小球藻不饱和脂肪酸得率下降。并且提取时间过长会导致更多的杂质溶出以及不饱和脂肪酸的氧化，使得脂肪酸品质下降。因此选取最佳提取时间为60 min。

在提取时间为60 min，提取温度为60 ℃的条件下，改变提取料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，分析提取料液比对小球藻不饱和脂肪酸得率的影响，结果如图1，料液比对小球藻不饱和脂肪酸得率影响显著(P<0.05)，当料液比在1:(10～30)范围内，随着料液比的增加，小球藻不饱和脂肪酸得率呈增加趋势，适当增加提取液的体积能够充分穿透小球藻细胞壁，对细胞内的脂质进行充分水解。然而随着料液比的持续增加，小球藻不饱和脂肪酸的得率并没有得到明显提高，可能是在这种提取条件下，能获得的小球藻脂肪酸已达最高。继续增加料液比会导致提取液的浪费，故选择料液比为1∶30。

在提取料液比为1∶20，提取时间为60 min的条件下，改变提温度分别为40、50、60、70、80 ℃，分析提取温度对小球藻不饱和脂肪酸得率的影响，结果如图1所示，提取温度对小球藻不饱和脂肪酸得率影响显著，且在50 ℃时小球藻不饱和脂肪酸得率达到最高。这可能是由于当温度较低时，不利于甲醇溶液穿透细胞壁，从而影响脂肪酸的提取。而当温度较高时，本来就不利于KOH的溶解，且会使更多的甲醇处于蒸发的气体状态，进一步不利于KOH的溶解从而不能有效提取小球藻不饱和脂肪酸，降低脂肪酸得率。因此选择最佳提取温度为50 ℃。

图1 提取料液比、时间、温度对得率的影响

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面法实验设计与结果

以小球藻不饱和脂肪酸得率为指标建立回归模型，并进行显著性检验。对表2中的实验设计数据进行二次多元回归拟合，可以得到小球藻不饱和脂肪酸提取工艺的数学模型：Y=3.36+0.013A-0.14B-0.15C-0.025AB+0.05AC+0.05BC-0.84A2-1.44B2-0.72C2，式中的Y代表小球藻不饱和脂肪酸得率、A代表小球藻不饱和脂肪酸的提取料液比、B代表小球藻不饱和脂肪酸的提取温度、C代表小球藻不饱和脂肪酸的提取时间。对回归模型进行方差分析，得到如表3所示数据。根据表3可知，小球藻不饱和脂肪酸得率的回归模型P<0.000 1达到极显著水平，失拟项结果P值0.116 5不显著，表明该模型和实际情况拟合度较好，可以通过此方程确定小球藻不饱和脂肪酸提取工艺的最优参数。其中A2、B2和C2都达到极显著水平，表明了提取料液比(A)、提取温度(B)和提取时间(C)这几个单因素对小球藻不饱和脂肪酸的得率均有显著影响，而交互因素AB、AC、BC都不显著，这说明各因素之间交互作用很小。

表2 中心组合实验设计与结果

表3 小球藻不饱和脂肪酸脂肪酸得率回归模型方差分析

2.2.2 各因素交互作用分析

通过建立的模型，研究表明小球藻不饱和脂肪酸得率的趋势随着提取料液比和提取温度的上升表现为先增加然后有一定程度的下降，原因可能是小球藻中不饱和脂肪酸已经被全部提取出，此时再升高提取温度小球藻不饱和脂肪酸的得率也无法进一步增加，且温度过高会导致小球藻不饱和脂肪酸的品质发生劣变[19]。根据等高线的密度和响应面的陡峭程度，可以判断出较高的料液比和较低的提取温度对小球藻不饱和脂肪酸的得率影响更加显著。

2.3 最优工艺条件

2.3.1 最佳工艺参数

根据单因素及响应面法优化实验得出提取小球藻不饱和脂肪酸的最佳工艺参数为料液比为1∶25、提取温度49.5 ℃、提取时间56.83 min。使用Design Expert 8.0.6软件拟合回归模型得到在此条件下，小球藻不饱和脂肪酸的理论得率为(3.37±0.006 9)%。

2.3.2 最优工艺验证实验

根据软件对比分析得出的最佳工艺参数(料液比为1∶25、提取温度49.5 ℃、提取时间56.83 min)结合实际条件取料液比为1∶25、提取温度50 ℃、提取时间60 min进行验证实验，小球藻不饱和脂肪酸的实际得率为(3.15±0.045)%，小球藻不饱和脂肪酸的实际得率符合模型预测，说明本次优化实验的结果稳定可靠。

2.4 小球藻不饱和脂肪酸成分分析

图2为小球藻不饱和脂肪酸的GC-MS谱图，对小球藻不饱和脂肪酸和大豆油的主要脂肪酸成分进行分析，由表4可知，小球藻不饱和脂肪酸的主要脂肪酸成分为亚油酸(C18∶2N6C)，占比为(62.96±0.86)%；其次为棕榈油酸(C16∶1)、棕榈酸(C16∶0)和油酸(C18∶1N9C)，占比分别为(12.14±0.025)%、(9.88±0.068)%、(8.62±0.037)%。根据李雅[20]的研究，采用浸提法提取出的小球藻油脂中，脂肪酸中含量最高的亚油酸占脂肪酸总量的33%。相较而言，本研究所用直接碱提法提取的小球藻不饱和脂肪酸的亚油酸含量高于浸提法。此外，由图2可知，采用直接碱提法提取所得小球藻脂肪酸种类较丰富，而浸提法提取所得脂肪酸种类较少，其原因可能是用浸提法提取时，所用的溶剂体系会对油脂中脂肪酸的成分造成降解[21],导致一些短链脂肪酸无法被提取。而碱提法则无需考虑溶剂对脂肪酸成分的影响。

图2 小球藻不饱和脂肪酸的成分分析图谱

图3 大豆油脂肪酸成分分析图谱

由图2、图3可知，小球藻不饱和脂肪酸和大豆油的主要脂肪酸成分类似，半数以上均为亚油酸(C18∶2N6C)，但小球藻不饱和脂肪酸中亚油酸含量比大豆油高120.002 9%；其次为油酸，大豆油中的油酸含量比小球藻不饱和脂肪酸要高(6.000 0±0.007 4)%；小球藻不饱和脂肪酸中第二主要脂肪酸为棕榈油酸，占比分别为(12.140±0.025)%，而大豆油中，棕榈油酸含量极微。相较于大豆油，小球藻不饱和脂肪酸的谱图有多个峰值指示，说明小球藻不饱和中脂肪酸种类更丰富。

表4 小球藻和大豆油不饱和脂肪酸主要成分及质量分数/%

2.5 添加小球藻不饱和脂肪酸提取物对大豆油油脂品质特性的影响

过氧化值体现的是油脂的氧化酸败程度，反映油脂质量的好坏。图4为添加不同浓度小球藻不饱和脂肪酸大豆油的过氧化值比较。大豆油组的过氧化值和C.PUFA1组无统计学差异，C.PUFA2和标品组的过氧化值显著高于大豆油组。这是由于C.PUFA2组和标品组的不饱和脂肪酸含量较大豆油显著升高，而油脂中的不饱和脂肪酸易发生氧化，油脂的不饱和程度越高氧化酸败速度越快[22]。但整体而言4种油脂的过氧化值均处于较低水平，远低于国家标准。

注:大豆油组和各实验组进行差异性分析，P<0.05*，P<0.01**。图4 4种不同组分油脂的过氧化值

酸价能体现油脂中游离脂肪酸的多少，游离脂肪酸是油脂发生水解的产物，因此酸价指示油脂的新鲜程度。图5为添加不同浓度小球藻不饱和脂肪酸大豆油的酸价比较，在大豆油中添加低质量浓度(25 mg/mL)小球藻不饱和脂肪酸时，酸价无明显改变，但添加较高质量浓度(50 mg/mL)小球藻不饱和脂肪酸和100 mg/mL亚麻籽油时显著提升大豆油的酸价。其原因是因为在大豆油中添加高浓度的小球藻不饱和脂肪酸和亚麻籽油可以显著升高大豆油中不饱和脂肪酸的含量，不饱和脂肪酸含量的升高不可避免的导致油脂更容易发生劣变。但在相同储藏条件下，4种油脂的酸价均未超过国家标准的4 mg KOH/g。

注:大豆油组和各实验组进行差异性分析，P<0.05*，P<0.01**。图5 4种不同组分油脂的酸价

3 结论

本研究通过单因素和响应面法实验得到小球藻不饱和脂肪酸最佳提取工艺参数：提取料液比1∶25、提取温度50 ℃、提取时间60 min，在此工艺条件下小球藻不饱和脂肪酸得率可达到(3.15±0.045)%。通过GC-MS和GC分别对小球藻不饱和脂肪酸和大豆油进行成分分析，发现小球藻不饱和脂肪酸相较于大豆油，在脂肪酸成分上其种类较丰富，品质较好。除此之外，还将不同比例的小球藻不饱和脂肪酸添加到大豆油中，通过碘值、酸价和过氧化值对其进行油脂品质特性分析。结果表明，添加较高浓度小球藻不饱和脂肪酸的大豆油过氧化值和酸价都显著升高，这是由于添加较高浓度小球藻不饱和脂肪酸会显著升高大豆油中不饱和脂肪酸的含量，在提升其营养价值的同时导致油脂更容易酸败。但过氧化值和酸价都在国家标准规定范围之内，提示在大豆油中添加小球藻不饱和脂肪酸并不会使大豆油的品质严重劣变。