睡莲多酚提取工艺优化及其抗油脂氧化作用

宋 杰 郭子雨 姚雨含 李晨阳 赵 军

(新疆大学生命科学与技术学院1，乌鲁木齐 830046) (新疆药物研究所维吾尔药重点实验室2，乌鲁木齐 830004)

睡莲，多年生水生草本植物，属睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属植物，广泛分布于热带、亚热带及温带地区。该属植物不仅具有较高的观赏价值，而且具有较好的食用和药用价值，其花朵可泡茶，叶柄和花柄可食用。研究显示睡莲含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素等多种营养成分，具有美容、降血脂、保肝、增强免疫等生物活性[1-3]。作为一种新型水生蔬菜，近年来睡莲在我国湖北省仙桃、洪湖及江苏省宿迁等地进行大量培育、销售，且每年产值超过1 000万，取得了很好的经济效益。雪白睡莲NymphaeacandidaPresl，是一种主要生长在我国新疆伊犁、阿勒泰、博湖等地的睡莲。该植物的花具有清热养肝、止咳消炎等功效，在临床上用于流行性感冒、肝炎等疾病的治疗[4-6]。以睡莲酚isostrictiniin、烟花苷为代表的的多酚类成分是该植物主要特征性成分，该类成分具有较好的抗氧化效果[7]和保肝活性[8]。此外，从可食或药食同源植物资源中寻找具有显著抗氧化的食品添加剂越来越受到人们的关注。因此，本实验以多酚提取率为指标，通过单因素考察结合正交设计优化睡莲多酚的超声提取工艺，并探讨通过大孔树脂和聚酰胺联用纯化后睡莲多酚的抗油脂氧化作用，以期为开发新型天然抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

睡莲花：经新疆药物研究所鉴定为睡莲科睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲NymphaeacandidaC. Presl的干燥花蕾。

睡莲酚Isostrictiniin对照品(自制，质量分数为 98.7%)；鲜榨葵花籽油和菜籽油；猪油(自制)；抗坏血酸；特丁基对苯二酚(食品级)；柠檬酸；可溶性淀粉；异辛烷、冰乙酸、硫代硫酸钠等其他试剂均为分析醇。

1.2 实验仪器

WV-754紫外可见分光光度计，AL204 电子天平，RHP-1000A型高速多功能粉碎机，AS10200ADT超声玻璃清洗器，XMTD-8222电热恒温水浴箱，DUG-9123电热恒温鼓风干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 睡莲药材的处理

睡莲花经挑除梗、石子后，粉碎、过40目筛。

1.3.2 标准曲线的绘制

称取睡莲酚对照品 10.8 mg，用30%甲醇溶解定容至50 mL的容量瓶中，即得 0.216 mg/mL 的睡莲酚对照品溶液。精密吸取对照品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL分别置于 25 mL容量瓶，并加 30%甲醇稀释至刻度，摇匀定容后备用。将对照品溶液分别取1.0 mL置于10 mL具塞量筒中，经避光处理，加入20%福林酚溶液5.0 mL，混匀反应5 min后，再加入7.5%的Na2CO3溶液5 mL后，振荡摇匀，静置1 h，在波长765 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。以对照品溶液的浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)进行线性回归，得回归方程为y=8.333 3x+0.023 9，r=0.999 8；且在 0.017～0.086 mg/mL范围内有着良好的线性关系。

1.3.3 睡莲多酚的提取

称取1.0 g睡莲花粉末于具塞瓶中，加入一定量的乙醇溶液,置于超声功率为90 W的超声仪中，超声一定时间后，过滤得提取液，将提取液水浴锅蒸干，真空干燥，即得富含睡莲酚的提取物，计算出膏率。再称取干燥的睡莲提取物11.0 mg，用30%甲醇溶解定容至25 mL的容量瓶中，得待测样品溶液。精密吸取4.0 mL，用30%的甲醇溶液稀释定容至25 ml的容量瓶中，然后按标曲绘制方法测定其吸光度，根据回归方程计算溶液中睡莲多酚的质量浓度，并计算提取率：提取率= 提取物中睡莲多酚的含量×出膏率/100%。

1.3.4 睡莲多酚的提取工艺优化

1.3.4.1 单因素考察

以睡莲多酚提取率为指标，分别考察各单因素乙醇体积分数(10%、30%、50%、70%)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、超声温度(30、40、50、60、70 ℃)和超声时间(20、30、40、50、60 min)对睡莲多酚提取效果的影响。

1.3.4.2 正交优化实验

在单因素实验的基础上，按照 L9(34) 正交设计表优化睡莲多酚的提取工艺。以睡莲多酚提取率为指标，选择超声时间、料液比、乙醇体积分数作为影响睡莲多酚提取效果的影响因子(见表1)，以此探究最优提取条件。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 睡莲多酚的纯化

以最优条件超声提取200 g睡莲花，得到睡莲多酚提取物。按文献方法[8]稍加改进进行睡莲多酚的纯化：提取物用适量水溶解，上D101型大孔树脂柱，先用10倍柱体积的水除杂，再用8倍柱体积的30%乙醇洗脱，减压浓缩并干燥，得浸膏。浸膏通过30～60目聚酰胺柱进一步纯化，用10倍柱体积的水除杂，再用8倍柱体积的70%乙醇洗脱，减压浓缩并干燥，即得纯化后的睡莲多酚。

1.3.6 睡莲多酚抗油脂氧化实验

将睡莲多酚(终质量分数0.02%、0.04%、0.08%)、TBHQ(终质量分数0.02%)和VC(终质量分数0.02%)分别用0.5 mL的无水乙醇完全溶解，然后分别加入到100.0 g 葵花籽油、菜籽油、猪油中，并以空白油样作为对照，混合摇晃。避光处理后，置于(60±1) ℃的恒温烘箱中，每隔12 h振摇1 min，并互相交换位置，每3 d按GB 5009.227—2016的方法，称取2～3 g的油样测定各油样的过氧化值(POV)。同时，按此方法，测定睡莲多酚与其他抗氧化剂复配后的抗油脂氧化效果。

1.4 数据处理

利用正交设计助手Ⅱv3.1进行实验设计及数据处理，并通过Excel绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

如图1所示，睡莲多酚提取效果随乙醇体积分数的升高而增加，在乙醇体积分数为50%时提取率可达11.86%，而当继续升高乙醇体积分数，此时将会导致睡莲多酚提取率下降。以50%乙醇提取，提取率最高，可能是因为在此体积分数时，睡莲多酚的溶解性较大，且很容易于从植物组织中释放。因此选取50%为最佳乙醇体积分数。

睡莲多酚提取率随着料液比的增加逐渐增大，当增加至一定程度(1∶40)时，其提取率将呈现降低趋势，这可能是由于过高的料液比会增加超声波破坏植物细胞的阻力，造成睡莲多酚溶出减少，从而降低了睡莲多酚的影响效果。因此选择1∶40 g/mL为最佳料液比。

睡莲多酚提取率随着超声温度的升高，呈先增加后下降趋势。这是由于温度的增加会加快分子的运动速率，有利于提取溶剂进入睡莲花的组织内部，加快睡莲多酚的溶出。但过高的温度会使睡莲多酚的稳定性降低，同时也会导致其它溶质的溶出，进而使该成分提取效果降低。如图1所示，当超声温度为60 ℃时，睡莲多酚的提取率最高，故而选取最佳超声温度为60 ℃。

超声提取可加快睡莲组织中睡莲多酚的溶出，随着时间的延长，呈现增大的趋势。然而，超声时间越长，相应的杂质也溶出越多。杂质的溶出可导致睡莲多酚含量的降低，如图1所示，超声50 min时，多酚得率达到了11.32%，之后就开始降低。因此选择50 min为最佳提取时间。

图1 单因素实验结果

2.2 正交实验优化

在表2直观分析中，R值越大，则该因素对睡莲多酚提取率的影响越大。可对睡莲多酚提取影响因素的大小进行由大到小依次排序：B>C>A，即料液比>乙醇体积分数>提取时间。又由表2可知，处理9(A3B3C2)，即超声时间为60 min，料液比为 1∶50 g/mL，乙醇体积分数为50%，睡莲多酚提取率最高可达15.302 8%；其次为处理3(A1B3C3)，即超声时间为40 min，料液比为 1∶50 g/mL，乙醇体积分数为70%，睡莲多酚提取率达13.232 2%。

由表3方差分析可知，F超声时间=2.338，F料液比=27.421，F乙醇浓度=3.752。从而可知，料液比(B)对睡莲多酚提取效果具有显著性影响(P<0.05)，而超声时间(A)和乙醇体积分数(C)均对睡莲多酚提取效果的影响不显著(P>0.05)。

根据表2和表3结果分析可得，料液比对睡莲多酚提取率有显著性影响(P<0.05)，因此可选择B3；而超声时间和乙醇体积分数对睡莲多酚提取率无显著性影响(P>0.05)，且根据k值的大小发现：A1、A2与A3的均值相差不大，故从时间方面考虑，可选最佳超声时间为A1，而乙醇浓度C2值最大，故C2为最佳可取值。超声提取工艺的最优条件为A1B3C2，即超声时间40 min，料液比1∶50，乙醇体积分数50%为理论超声提取睡莲多酚的最佳工艺条件。

表2 超声提取正交实验设计与结果

表3 正交实验方差分析表

2.3 验证实验

准确称取1.0 g睡莲花粉末3份，按照最佳提取工艺条件提取所得睡莲多酚提取率分别为14.318%、14.639%、14.297%，平均值为14.418%， RSD为1.33%。该工艺方法合理、稳定，具有良好的重现性。

2.4 睡莲多酚的纯化

睡莲花200 g经过大孔树脂和聚酰胺联用纯化得到睡莲多酚15.62 g，其中多酚质量分数为(79.29±0.75)%。

2.5 睡莲多酚的抗油脂氧化作用

2.5.1 睡莲多酚对葵花籽油的抗氧化作用

由图2可知，葵花籽油的过氧化值随着时间的增加也在不断的增加，不仅不同组的抗氧化剂对葵花籽油有着不同程度的抗氧化性，而且各实验组测定的过氧化值均低于空白对照组的。随着睡莲多酚剂量的增大，其过氧化值增加的速度下降，当添加0.08%的睡莲多酚，可发现其测定的过氧化值与添加0.02%的VC和0.02%的TBHQ值不相上下。因此高剂量0.08%的睡莲多酚的抗氧化性能较好。

图2 睡莲多酚抗葵花籽油过氧化值影响

2.5.2 睡莲多酚对菜籽油的抗氧化作用

由图3可知，菜籽油的POV随加速氧化时间的延长均呈上升趋势，对照组和各个实验组均表现出不同的氧化速度。又可由空白对照组的POV明显高于各个试验组所测定的POV，表明睡莲多酚对菜籽油具有良好的抗氧化作用。且其抗氧化效果由强到弱依次为:0.02%VC>0.02%TBHQ>0.08%睡莲多酚>0.04%睡莲多酚>0.02%睡莲多酚。

图3 睡莲多酚抗菜籽油过氧化值影响

图4 睡莲多酚抗猪油过氧化值影响

2.5.3 睡莲多酚对猪油的抗氧化作用

由图4可知，睡莲多酚对猪油的氧化具有较好的抑制作用。随着睡莲多酚的添加量的增大，猪油产生氢过氧化物的能力的下降，表明不同剂量睡莲多酚对猪油的抗氧化效果存在着正相关关系，且0.08%的睡莲多酚的抑制能力接近于0.02%的VC和0.02%的TBHQ抑制能力。

2.5.4 睡莲多酚与其他抗氧化剂对猪油的协同增效作用

分别将0.02%TBHQ+0.02%睡莲多酚，0.02%VC+0.02%睡莲多酚这2种复配物及0.02%VC和0.02%TBHQ加入到 100 g 猪油中，并以猪油作空白对照组，通过烘箱法每3 d测定各油脂的过氧化值，探究睡莲多酚与其他抗氧化剂复合对抑制猪油氧化的协同增效作用。如图5所示，空白猪油组的过氧化值明显高于各实验组的，且在第9天后随着时间的延长急剧升高。将0.02%TBHQ+0.02%睡莲多酚，0.02%VC+0.02%睡莲多酚复配实验组的过氧化值分别与0.02%VC和0.02%TBHQ实验组的过氧化值相比，发现0.02%VC+0.02%睡莲多酚复配实验组的过氧化值明显低于0.02%VC实验组的，而0.02%TBHQ+0.02%睡莲多酚复配实验组的过氧化值与0.02%TBHQ实验组的过氧化值不相上下。因此，睡莲多酚与VC抗氧化剂复配后具有显著的增效作用。

图5 睡莲多酚和不同抗氧化剂复合抗猪油过氧化值影响

3 结论

本研究通过单因素考察结合正交实验优化雪白睡莲中睡莲多酚的超声提取工艺，结果显示，睡莲多酚提取的最优工艺条件为乙醇体积分数50%，料液比1∶50 g/mL，超声温度60 ℃，超声时间40 min，超声功率90 W，其中料液比影响显著。油脂抗氧化实验表明，睡莲多酚对葵花籽油、菜籽油和猪油均具有一定的抗氧化作用，且存在剂量效应关系。本实验复配抗氧化剂对猪油的抗氧化活性均强于0.02%睡莲多酚的，其中睡莲多酚+VC的抗氧化活性最佳。因此，睡莲多酚可作为天然抗氧化剂在油脂抗氧化领域具有较好的开发潜力。