基于线粒体COI和COII基因的米象与玉米象的分子鉴定

张 蒙 赵艳艳 鲁玉杰 高 晴

(河南工业大学粮油食品学院，河南粮食作物协同创新中心， 粮食储藏安全河南省协同创新中心，郑州 450001)

米象Sitophilusoryzea(Linnaeus)、玉米象SitophiluszeamaisMotschulsky均属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)，为中国粮油储藏技术规范中规定的主要害虫[1]。广泛分布于全世界多个国家和地区，在我国亦是分布广泛且危害严重的储藏物蛀食性害虫[2]。

米象可以在田间感染粮食，在经收获入仓的粮食中通常已隐藏卵、幼虫或蛹期的害虫，这些隐蔽虫态在粮粒内取食发育，影响粮食品质，造成储粮损失及相当严重的危害[3]。米象和玉米象同属象甲科，为近缘种，二者幼虫和成虫在外部形态上极其相似，而且此两种象虫的食性、为害方式、越冬场所、上爬假死等生活习性及影响它们生长发育和繁殖的温度、湿度、天敌等生态因子也很相似，仅靠观察两者外部形态进行区分十分困难[4]。但这两种害虫对杀虫药剂的抗药性有很大的差别，在储藏物防治上也存在不同的难度，根据已发表的研究调查和报道，米象已出现较高磷化氢抗性的品系，而玉米象尚未见到有明显磷化氢抗性的品系[5]，故快速的鉴定米象和玉米象对采取相应的防治措施十分重要。

为了快速准确的鉴别近缘物种，Tautz等[6]在DNA分类学(DNA Taxonomy)的基础上提出DNA条形码技术，即利用一段标准基因的序列做标记，通过PCR技术和基因序列分析的分子鉴定技术来鉴别检测不同物种和相同物种间不同个体差异的目的。标准基因序列的选择既应该足够保守，利用通用引物能够大量扩增，又应该有足够的变异来区分不同物种DNA序列[7]。线粒体DNA(mtDNA)中的细胞色素氧化酶I(COI)基因和细胞色素氧化酶II(COII)基因序列被广泛用做标准序列对物种进行快速准确的鉴定和分类。陈春生等[8]利用线粒体COI基因基于PCR技术扩增mtCOI基因序列并测序，然后构建分子进化树建立了对鼠类不同物种进行快速鉴定和分类的方法。彭居俐等[9]研究了基于线粒体COI基因的4种鲌属鱼类进行物种鉴定。王康等[10]基于线粒体COI和COII基因序列差异建立了沙果小食心虫和梨小食心虫的分子鉴定方法，解决了快速准确鉴别这2种食心虫的难题。倪艳等[11]通过对6种斑粉蝶的COI和COII基因的部分序列进行分析并对聚类关系进行分析，结果和形态学结果一致并探讨了斑粉蝶属Delias的系统发生关系。众多研究都表明利用线粒体COI和COII此两个基因序列的差异可对近缘种进行分子鉴定。

本研究从不同地区的粮食储备库采集米象和玉米象试虫，提取试虫的基因组DNA，利用PCR扩增试虫的线粒体COI和COII基因序列，将所获得的基因序列在GenBank中进行BLAST比对和基因序列相似性分析，然后分别计算基于COI和COII基因序列的玉米象、米象种内及种间遗传距离，并分别构建COI和COII基因单倍型的系统发育树，以此建立近缘种米象和玉米象的分子鉴定方法，为这2种储粮害虫的快速准确鉴定及预测预报提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 试虫来源

本研究所用的米象和玉米象样本采自于河南郑州、广西南宁、山东烟台、江苏通州、四川成都、广东中山、湖南长沙、北京中粮的某粮库或加工厂。试虫样本均以水分16%的小麦为饲料，在温度为28～32 ℃、相对湿度为65%～75% RH的恒温培养箱中，于黑暗条件下培养，用于形态学鉴定和DNA提取。用于研究的试虫样本的信息如表1所示。

表1 米象和玉米象试虫信息

1.2 基因组DNA提取

在采集的样本中，随机挑选米象和玉米象样本，每个地理种群选取5头试虫用于单头试虫DNA的提取。利用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取试虫的基因组DNA，提取方法参考试剂盒说明书中的步骤进行。提取的基因组DNA置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 PCR扩增及序列测定

根据已发表研究，选用和设计扩增米象和玉米象COI和COII基因的引物。扩增米象和玉米象线粒体COI基因的通用引物LCO1490/HCO2198[12-14]，分别为：

LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，

HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA；

根据NCBI数据库中的米象和玉米象线粒体COII基因序列，参考已有报道[15]，并稍作修改，设计扩增COII基因片段的上下游特异性引物分别为： COIIF-5'-TCTAATAGAACACCTTACCTTA-3'，COIIR-5'-CCACAGATTTCAGAGCATTG-3'。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR扩增反应总体系为25 μL，其中DNA模板4 μL，上游和下游引物各2 μL(10 μM)， 12.5 μL Premix Taq(TaKaRa TaqTM)，加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，退火延伸45 s(COI基因Tm：56 ℃，COII基因Tm：58 ℃)，72 ℃延伸45 s，进行35个循环；循环结束后再72 ℃延伸6 min。所有PCR扩增获得的片段，在1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳检测为目的条带的PCR产物进行切胶回收，胶回收采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行，具体方法参考试剂盒说明书。最后将纯化产物送往生工生物工程(上海)有限公司进行双向测序。

1.4 序列分析

将测序所得的序列在GenBank中进行BLAST比对搜索，并使用DNAman6.0进行序列拼接，将拼接好的序列使用MEGAV7内含的ClustalW进行序列比对；利用DNAsp软件打开比对对齐后的序列，分别获得COI及COII基因序列的单倍型数目。利用MEGAV 7.0分别计算米象和玉米象的COI及COII基因序列的碱基组成(A、T、C、G平均百分含量)，以及各自所含有的C (保守位点)、V (变异位点)、Pi (简约信息位点)和S (自裔位点)以及所占的百分含量(%)，基于Kimura-2-parameter (K2P) 双参数模型计算米象和玉米象两种象虫的种内及种间遗传距离，并使用邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，对各分支置信度(bootstrap)进行1 000次的重复检验。

2 结果与分析

2.1 米象和玉米象线粒体COI和COII基因序列分析

本实验成功扩增得到所有米象和玉米象试虫的线粒体COI和COII基因序列，其中COI基因序列长度为712 bp，COII基因序列长度为546 bp。将所得序列在GenBank中进行BLAST比对和相似度分析，结果表明，本实验获得的米象COI基因和COII基因序列与GenBank中登录的米象COI基因(登录号：GU196317.1)和COII基因(登录号：KX190700.1)对应序列的相似性分别为98.87%～99.70%和99.72%～100%；测得玉米象COI基因和COII基因序列与GenBank中登录的米象COI基因(登录号：KU757289.1)和COII基因(登录号：KX373614.1)对应序列的相似性分别为98.73%～99.55%和99.46%～100%。

注：白色代表种间变异位点,下同。图1 米象和玉米象COI基因序列比对

米象和玉米象COI和COII基因序列的比对结果分别见图1和图2。试虫样本共获得9个米象的COI基因单倍型(GenBank登录号：MT863612、MT863611、MT863610、MT872410、MT872409、MT872406、MT872408、MT872411、MT872405)，这9个单倍型在10个碱基位点上具有多态性，9个单倍型之间的相似度在98.6% 以上。试虫样本共获得1个玉米象的COI基因单倍型(GenBank登录号：MT863609)。米象和玉米象COI基因种间的相似度在85.84%～86.92%，COI基因在2种象虫之间存在42个变异位点(图1)。

试虫样本共获得3个米象COII基因单倍型(GenBank登录号：MW119321、MW119322、MW119323)，这3个单倍型在 2个碱基位点上具有多态性，9个单倍型之间的相似度在99.6% 以上。试虫样本共获得8个玉米象COII基因单倍型(GenBank登录号：MW119313、MW119314、MW119315、MW119316、MW119317、MW119318、MW119319、MW119320)，这8个单倍型在 10个碱基位点上具有多态性，8个单倍型之间的相似度在98.2% 以上。米象和玉米象COII基因种间的相似度在84.47%～87.66%。米象和玉米象COII基因种间的相似度在86.42%～88.14%，COII基因在2种象虫之间存在21个变异位点(图2)。

图2 米象和玉米象COII基因序列比对

利用MEGAV7软件进行序列比对，分析COI和COII基因序列碱基组成。COI基因序列的712个碱基位点中，C保守位点521个，比例约为78.46%，COII基因序列的549个碱基位点中，保守位点457个，比例约为84.47%；COI基因序列V变异位点142个，比例约为21.38%，COII基因序列V变异位点84个，比例约为15.52%；COI基因序列Pi简约信息位点91个，比例约为13.70%，COII基因序列Pi简约信息位点29个，比例约为5.36%；COI基因序列S自裔位点51个，比例约为7.68%，COII基因序列S自裔位点55个，比例约为10.16%；COI基因序列T、C、A、G四种碱基的平均含量为34.30%、19.70%、30.70%、15.30%，A+T的平均含量为65.0%，C+G的平均含量为35.0%。COII基因序列T、C、A、G四种碱基的平均含量为34.50%、9.90%、36.00%、19.60%，A+T的平均含量为70.00%，C+G的平均含量为29.50%，核苷酸碱基构成均出现了明显的A+T含量偏倚现象，此现象皆符合昆虫线粒体碱基组成的特点[21]。

2.2 遗传距离

本研究使用MEGAV7软件基于K2P模型计算出米象和玉米象的COI基因和COII基因序列间的遗传距离。由表2可以看出，米象COI基因序列间的遗传距离在0.002～0.020，相似度为98.0%～99.8%，2种象虫COI基因种间遗传距离为0.145～0.162，相似度为93.8%～95.5%，种间遗传距离显著高于种内遗传距离(df=43，t=73.534，P<0.001)。

由表3可以看出，玉米象COII基因序列间的遗传距离在0.001～0.023，相似度为97.77%～99.92%，米象COII基因序列间的遗传距离在0.011～0.015，相似度为98.37%～98.73%，2种象虫COII基因种间遗传距离为0.128～0.154，相似度为86.27%～88.31%，种间遗传距离显著高于种内遗传距离(df=53，t=3.925，P<0.001)。

表2 米象和玉米象COI基因单倍型间遗传距离和相似度

表3 米象和玉米象COII基因单倍型间遗传距离和相似度

2.3 系统发育树

以绿豆象CallosobruchuschinensisLinnaeus COI基因序列(GenBank登录号：AY625416.1)作外群，将本实验获得的9个米象COI基因单倍型序列和2个已登录的米象COI基因序列(GenBank登录号：AY131099、GU196318)，以及1个玉米象COI基因单倍型序列和2个已登录的玉米象COI基因序列(GenBank登录号：AY131100、MG968936)构建系统发育树，结果分析显示(图3)，米象和玉米象的COI基因单倍型明显分开，所有的米象COI基因单倍型各自聚在一支。

以绿豆象C.chinensisLinnaeus COII基因序列(GenBank登录号：DQ459027.1)作外群，将本实验获得的3个米象和8个玉米象COII基因单倍型序列构建系统发育树，结果分析显示(图4)，所有米象COII基因单倍型聚为一支，所有玉米象COII基因单倍型另外聚为一支。

图4 基于米象和玉米象COII基因单倍型的系统发育树

SZ1和SO1～SO9为本研究获得的玉米象和米象COI基因单倍型；AY131100和MG968936为GenBank已登录的相应玉米象COI基因序列；AY131099和GU196318为GenBank已登录的相应米象COI基因序列；AY625416.1为GenBank已登录的相应绿豆象COI基因序列SZ1～SZ8和SO1～SO3为本研究获得的玉米象和米象COII基因单倍型；DQ459027.1为GenBank已登录的相应绿豆象COII基因序列。

3 讨论

基于线粒体COI和COII基因扩增不同地理种群的米象和玉米象试虫，获得多条基因序列，分析得到9个米象和1个玉米象的COI单倍型序列，以及3个米象和8个玉米象COII单倍型序列，结果表明，基于线粒体COI和COII基因的米象和玉米象的种内遗传距离均小于0.023，而种间遗传距离均大于0.128，种内距离和种间距离间不存在重叠区域[16]，并且种内遗传距离与种间遗传距离差异显著(P< 0.001)。因此，本研究所采用的线粒体COI和COII基因序列可以准确应用于米象和玉米象的近缘种鉴定。

基于PCR技术的分子鉴定技术，尤其线粒体COI和COII基因序列目前已广泛地应用到昆虫近缘种的鉴定中[17-20]。在利用线粒体基因进行分子鉴定时，不同物种间相同的线粒体基因核苷酸序列差异是最重要的标准[21]。Hebert等利用COI基因序列比较分析多种鳞翅目昆虫后发现，COI基因核苷酸序列3%的差异可以作为鉴定不同物种的标准，即不同物种COI基因差异大于3%，同一物种COI基因序列差异小于3%，目前大量的相关研究证实了这一标准的准确[22]。

近年来，随着分子生物学的迅速发展，以及PCR技术的日益成熟，分子生物学技术越来越多的用于物种分类和鉴定中，其优点是在精细的分子水平能够快速、精确的对物种进行分类，尤其是近缘种的快速区分，但由于这些分子技术研究的分子标记片段单一，因此适用范围因数据库中参照序列而受限[23]。传统形态学进行鉴定和分类的方法，则需要在识别和描述形态外观和解剖特征上花费很多时间和精力，且此方法极容易受解剖操作及其他因素影响，在鉴定和分类上存在一定的局限[20]。目前，随着研究方法和技术的不断改进和更新，利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列作为标记越来越多的运用于不同物种的分子鉴定中，旨在形成一种快速、准确、经济实惠及普遍适用的鉴定和分类方法，以满足不同研究领域和行业对于不同物种鉴定和分类的迫切需求。

4 结论

本研究结果表明，在6个地理种群的米象和2个地理种群的玉米象样本中，米象、玉米象的COI和COII基因种内相似度在97.77% 以上，种间相似度在85.84%～88.31% 之间，且2个基因的种间遗传距离显著高于种内遗传距离，米象、玉米象的COI和COII基因单倍型分别在系统发育树上明显各自聚为一支，同种象虫的基因序列位于相同的进化枝。因此，本研究所采用的线粒体COI和COII基因可以用于近缘种米象和玉米象的分子鉴定。