RNAi在储粮害虫防治应用中的研究现状及展望

王康旭 陈二虎 唐培安

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023)

以RNA干扰(RNA interference, RNAi)为代表的基因沉默技术是当今生命科学领域最重要的革命性成果之一[1]。通过向生物体内导入靶向目标基因的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)片段，经过细胞识别和吸收后，在细胞质中dsRNA分子会被 Dicer-2(Dcr2)酶切割成为18～25 bp左右的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA能够招募相关蛋白聚集形成沉默复合体(RISC)，并通过siRNA序列互补特性引导 RISC识别靶 mRNA使之降解，从而实现对目标基因的特异性抑制[2]。目前，RNAi技术被广泛用于功能基因组学、疾病治疗等领域[3]。与此同时，RNAi也给现代农业带来了巨大的发展契机，为作物性状改良、有害生物防控和粮食储藏等方面提供了新的研究思路和应用策略。

储粮害虫严重影响了世界粮食及食品安全。据联合国粮农组织计算，在发达国家中，因害虫导致的储粮损失年均在5%～10%，而在发展中国家中，这一数字则高达30%[4]。而实际上，由于害虫活动所造成的食品污染、防治成本等因素，使得储粮害虫所造成的损害远高于目前的统计数字。

磷化氢熏蒸是目前应用最为广泛的储粮害虫防控技术，然而，由于在储粮保护领域长达60余年的单一使用，越来越多的害虫种群对磷化氢产生了抗药性，新型害虫防治技术的开发迫在眉睫[5]。利用RNAi技术，一方面我们可以筛选并抑制跟害虫抗药性产生相关的关键基因，通过解决抗性问题恢复害虫对药剂的敏感性[6]；另一方面通过RNAi技术能够筛选出害虫防治的靶标基因，以dsRNA作为新型核酸农药直接应用于害虫防治。

基于RNAi的害虫防治技术具有较高的物种专一性，另外，通过选择不同的靶标基因以及不同的dsRNA片段可以控制抗性害虫的产生，因此被认为具有重要的生产应用前景[7]。近年来，多篇综述从其作用机理、效率影响机制等方面对RNAi技术在作物害虫防治领域的研究情况进行了系统性的总结[7-9]。而本文将首次从储粮害虫防控的角度，对RNAi技术的重要进展和应用前景进行概括，期望为未来利用该技术对储粮害虫进行生物学研究以及绿色防治提供参考。

1 RNAi在储粮害虫中的研究现状

总的来说，基于RNAi的害虫防控就是通过设计合适的dsRNA序列，使其特异性地靶向害虫生长发育过程中的必需基因，在dsRNA进入害虫细胞后激活RNAi反应，从而抑制靶标基因的表达来降低虫体的适应性甚至产生死亡。2017年，美国环保署(EPA)批准了第一个基于RNAi的害虫防治产品，标志着RNAi害虫防治产品的商品化开端[10]。值得注意的是，储粮害虫中的RNAi研究起步较早，尤其是在靶标基因筛选、应用途径等方面进行了大量的探索，取得了一些重要进展。

1.1 RNAi应用于鞘翅目储粮害虫的可行性情况

鞘翅目是储粮昆虫中种类最多、数量最大的一类害虫，该类昆虫不仅能够直接取食储藏的粮油食品，还能通过次级代谢物的分泌对储粮产生间接的危害，同时多种鞘翅目害虫已经对传统的熏蒸方式产生了较高的抗性，因此，开发基于RNAi的新型害虫防治方法对该类害虫防控的意义重大[4,11,12]。在储粮昆虫中，赤拟谷盗是最早使用RNAi进行研究的对象，Brown等[13]在赤拟谷盗卵期注射致畸基因Deformed的dsRNA，导致胚胎畸形和死亡，并且随着赤拟谷盗全基因组的测序，该虫逐渐作为模式昆虫被广泛用于RNAi的研究之中。对于该虫的研究表明，跟发育相关的基因能够作为潜在的RNAi靶标位点用于害虫防治。例如，Arakane等[14,15]就发现向赤拟谷盗幼虫微量注射几丁质去乙酰化酶基因(ChitinDeacetylase,CDA)或几丁质合成酶基因(ChitinSynthase,CHS)的dsRNA后，试虫的几丁质代谢被干扰，死亡率显著提高。相较于零星的功能基因鉴定，“iBeetle” 项目则利用dsRNA显微注射技术在全基因组解析的基础下对1/3的赤拟谷盗基因(约5000个)进行了大面积的功能分析，对每个候选基因沉默后的表型进行了统计[16]，在此基础上，Ulrich等[17]通过分析抑制后出现致死表型的快慢和死亡试虫比例对致死基因进行筛选，挑选出了11个防治赤拟谷盗效率最高的RNAi靶标基因(表1)，而这些基因在其他物种中的同源基因同样表现出了极强的致死效应[18]。另外，在赤拟谷盗中的研究还表明，利用RNAi抑制部分细胞色素P450基因的表达能够使得抗性害虫恢复对磷化氢等化学药剂的敏感性，为抗性治理提供了新思路[19,20]。

伴随着RNAi在赤拟谷盗中的大量应用，该技术在其他鞘翅目储粮害虫中的效果也逐渐得到了证实。在玉米象(Sitophiluszeamais)中，Vallier等[21]通过dsRNA注射(200 ng/头)将肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Protein)基因的表达量敲低至对照组的2%，而Huang等[22]利用dsRNA喂食玉米象，抑制了细胞色素P450相关基因的表达，提高了试虫对松油烯-4-醇的敏感性。在烟草甲中，研究人员通过向初孵幼虫连续喂食含有靶向致死基因SNF7或26Sprot的dsRNA溶液，20 d后的试虫死亡率分别为95%和93%[23]。在锈赤扁谷盗(Cryptolestesferrugineus)中，Zhang等[24]分别通过喂食和注射dsRNA的方式，成功抑制了几丁质合成酶基因CHS2的表达。另外在药材甲(Stegobiumpaniceum)中，通过注射靶向几丁质乙酰化基因CDA1的dsRNA，可以影响试虫的蜕皮现象，进而造成试虫死亡[25]。

表1 赤拟谷盗RNAi高效致死基因

通过以上研究可以发现，抑制害虫生理及生长发育中关键基因表达，能够影响害虫的生长发育情况，从而导致害虫的死亡，这也表明利用RNAi防治鞘翅目储粮害虫的可能性高。

1.2 RNAi应用于其他储粮害虫的可行性情况

除了鞘翅目甲虫外，还有蜚蠊目、啮目和鳞翅目中的昆虫同样对储粮造成了严重危害。其中，研究人员利用蜚蠊目害虫作了大量RNAi相关工作。Martin等通过向德国小蠊(Blattellagermanica)幼虫和成虫注射dsRNA，抑制了核受体基因(RXR/USP)的表达[26]，从而大大提高了试虫死亡率；另一个研究中，研究人员向德国小蠊末龄幼虫注射靶向蜕皮激素受体基因(ecdysonereceptorisoform-A)的dsRNA，导致试虫出现了发育迟缓、畸形等现象，最终产生了明显的防治效果[27]；Lin等[28]则向德国小蠊喂食脂质体载体包裹的dsRNA，通过沉默微管蛋白基因(α-tubulin)造成了害虫死亡。在另一种储粮中常见的蜚蠊目害虫美洲大蠊((Periplanetaamericana)中，Wang等[29]利用注射和喂食dsRNA的方式，显著抑制了美洲大蠊几丁质酶基因(Chitinase)的表达，抑制效率分别为82%以及47%；另外，我国科学家还利用RNAi技术对美洲大蠊全基因组测序后拼接比对的大量基因数据进行了功能鉴定，对影响该虫生长发育、免疫等生理现象的重要基因进行了解析，为基于RNAi的防治研究打开了新的思路[30]。

对于鳞翅目储粮害虫RNAi研究主要集中在印度谷螟(Plodiainterpunctella)中，Fabrick等[31]通过胚胎注射dsRNA的方式成功抑制了色氨酸加氧酶基因(tryptophanoxygenase)的表达，影响了孵化后幼虫的眼发育情况；Siaussat等[31]利用dsRNA注射，成功抑制了蜕皮激素(20-hydroxyecdysone)的生成，引起了下游发育相关基因的过量表达；Han等[32]通过dsRNA注射的方式激活了印度谷螟幼虫体内的RNAi反应，有效沉默了胞内钙非依赖型磷脂酶A2(Calcium-independent cellular phospholipase A2)基因的表达，从而提高了脂质过氧化水平，进一步分析还发现试虫的抗细菌免疫能力也受到了显著的影响。另外，在另一种鳞翅目储粮害虫粉斑螟蛾(Cadracautella)中，注射靶向卵黄原蛋白受体基因(vitellogeninreceptor)的dsRNA片段，可以导致成虫生育力以及幼虫孵化率的显著降低，产生了良好的防治效果[31]。

啮目的书虱类害虫同样对粮油食品的安全储藏造成了严重影响，对于其RNAi的研究发现，嗜卷书虱(Liposcelisbostrychophila)体内酯酶(Esterase)家族的部分基因在喂食dsRNA后能够得到显著抑制，进一步生测实验表明，试虫对马拉硫磷杀虫剂的敏感性也得到了明显的升高，提升了防治效率[33]。

通过以上研究可以发现，目前在储粮害虫中，对于鞘翅目和蜚蠊目昆虫的RNAi相关研究较多，但同时发现，虽然利用RNAi对鳞翅目及书虱类储粮害虫进行防治具有可行性，但仍需在靶标基因、应用方式等方面进行系统性探索。

2 影响储粮害虫RNAi效率的关键因素

RNAi具有极高的序列特异性，因此在具体应用过程中能够实现对害虫的专一性防治，近年的研究也表明，利用RNAi对储粮害虫进行有效防治的可行性较高，相关理论研究取得了很大的进展。但是，研究结果同样表明害虫的RNAi效率还会受到多种因素的影响。以下，将从昆虫种类与递送方式选择、靶标基因与dsRNA分子设计这两个方面进行重点介绍。

2.1 昆虫种类与递送方式影响RNAi效率

注射和喂食体外合成的dsRNA是在储粮昆虫学研究中使用最多的两种递送方式[6,34]。然而目前的研究结果表明，RNAi效率会随着昆虫种类和递送方式的不同而发生巨大的变化[35]。大部分鳞翅目昆虫对于dsRNA注射和喂食的敏感性都较低，一般情况下只有进行dsRNA大量注射才能实现靶标基因的显著抑制[36]，作者实验室的研究结果表明，利用人工饲料混合dsRNA对印度谷螟进行连续性喂食难以产生有效的RNA沉默。然而在德国小蠊和赤拟谷盗中，注射和喂食dsRNA被证明对其不同的靶标基因和生命阶段都是行之有效的[26,37]。近年来，研究人员针对昆虫RNAi种间差异开展了一些研究，发现dsRNA胞外降解、dsRNA细胞吸收和RNAi核心机制差异可能是导致昆虫RNAi种间效率差异的关键原因。

Wang等[29]利用包括美洲大蠊在内的4种不同害虫进行RNAi效率和降解比较实验发现，不同昆虫血淋巴的dsRNA降解能力是影响注射RNAi效率的重要因素，而肠道dsRNA降解能力是影响喂食RNAi效率的重要因素，昆虫种间的 RNAi效率差异与其体内的dsRNA酶促降解能力密切相关，这种降解能力决定了昆虫体内靶标组织附近的dsRNA暴露剂量从而影响了RNAi效率。在此基础上，Peng等[38]对不同种类昆虫的核酸酶生化特性进行了分析，然后又通过体外异源表达、基因沉默对赤拟谷盗体内的4种dsRNA酶(TCdsRNase)进行了功能鉴定，发现其中的TCdsRNase-1可能具体参与了外源dsRNA在肠道和血淋巴内的降解过程。另外，Guan等[39]发现了一种仅在几种鳞翅目昆虫种特异表达的核酸酶基因dsREase，通过功能验证，发现其能够快速降解dsRNA，但是目前该酶在鳞翅目储粮害虫中的功能尚待解析。

dsRNA只有进入细胞才能发挥出高效的RNA干扰效率。但是，dsRNA进入细胞涉及到多种机制和影响因素，而这些因素的种间差异都会导致RNAi效率的不同。在线虫中dsRNA的细胞吸收主要是通过跨膜通道蛋白SID-1(Systemic RNAi Defective-1)的运输[40]，而Tomoyasu等[41]发现沉默赤拟谷盗体内SID-1相关基因并不影响RNAi效率，之后，Xiao等[42]发现网格蛋白介导的内吞作用可能具体介导了dsRNA进入赤拟谷盗细胞的过程。但是研究人员发现，胞饮作用、吞噬作用以及SID-1通道蛋白对于其他种类害虫吸收dsRNA也具有重要的意义[43]。另外，在dsRNA入胞过程中，内体逃逸和载脂蛋白同样影响了dsRNA的内化效率。因此，研究代表性储粮害虫中的dsRNA吸收机制有助于针对性提高RNAi防治效率。

RNAi 核心机制会影响沉默效率。一方面是核心机制的基因元件组成情况影响了RNAi效率，例如在赤拟谷盗中RNAi核心基因Ago2和R2D2各有两个同源基因，而在一些RNAi效率较低的昆虫中则只有一个[41]；同时，Yoon等[44]在赤拟谷盗中鉴定出了鞘翅目特有的StaufenC基因，该基因参与了赤拟谷盗高效RNAi过程。另一方面，核心基因的表达情况影响了RNAi效率，例如当 dsRNA被注射进入德国小蠊时，关键基因Dcr2能够在6 h内上调 5 倍，而在多数RNAi低效昆虫中则没有发现这种现象[8]。这些因素可能是导致昆虫种间RNAi效率多样性的原因之一。

2.2 靶标基因与dsRNA分子设计影响RNAi效率

合适的RNAi靶标基因需要具有：1)蛋白产物半衰期较短；2)表达于dsRNA较易到达的体内位置。例如在赤拟谷盗体内，烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors)的稳定期大于 2 周，因此很难通过沉默该基因进行害虫防治[45]；另外，昆虫体内的中央神经系统和生殖器官有类似于人体内血脑屏障的机制，影响了dsRNA体内分布[35]。

dsRNA 分子长度和靶向序列位置的选择是设计 RNAi 实验时需要考虑的两个重要因素。在dsRNA长度选择上，研究人员发现RNAi效率同dsRNA长度存在正相关，例如在赤拟谷盗中，Miller等[37]发现69-520 bp的dsRNA都能产生显著的沉默效果，其中长dsRNA激发的RNAi更明显；在此基础上，Wang等[46]发现不同长度dsRNA在赤拟谷盗中产生的RNAi效率遵循以下规律：480 bp≈240 bp>120 bp>60 bp>>21 bp，进一步研究表明赤拟谷盗RNAi核心机制对不同长度dsRNA的亲和力没有明显差异；21 bp dsRNA在赤拟谷盗中无法发挥RNAi作用的原因是细胞吸收障碍；而导致dsRNA效率出现480 bp ≈ 240 bp>120 bp>60 bp的主要原因，是昆虫体内核酸酶对不同长度dsRNA的降解能力存在差异。对dsRNA靶向序列位置的研究发现，由同一个目标基因设计的不同位置的dsRNA所产生的基因沉默效果会有一定差异，例如在赤拟谷盗中，dsRNA具有较多的剪切偏好性位点，而在鳞翅目害虫中具有特定的dsRNA剪切偏好性位点(例如GGU)[47]。所以在RNAi应用中要关注该问题。

3 提高储粮害虫RNAi效率的有效方法

提高害虫 RNAi 敏感性的主要思路在于提高 dsRNA 在昆虫体内的持续性，增加细胞吸收能力以及核心元件的工作效率。目前主要有转基因和基因载体两种方法在昆虫学领域得到了广泛应用。在农业害虫中，基因载体得到了大量的应用，例如He等[48]利用荧光纳米载体FNP在亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)中提高了喂食RNAi效率，Zheng等[49]利用多聚物在大豆蚜(Aphisglycines)中实现了dsRNA触杀效果等。在储粮害虫研究过程中，研究人员发现脂质体、壳聚糖和量子点等基因载体也有助于增加dsRNA在害虫体内的递送效率。具体来说，Avila等[50]利用支链两亲多肽(BAPC)提高了喂食dsRNA在赤拟谷盗体内的运输扩散能力，提高了RNAi效率；在德国小蠊中的研究表明，脂质体材料可以保护dsRNA免遭体液中核酸酶降解，从而实现了100%的致死效率[28]，另外，Huang 等[51]用脂质体包被dsRNA的方法，发现只需要少量dsRNA就能在德国小蠊体内实现对靶标基因的沉默效果；在鳞翅目储粮害虫中，作者以印度谷螟为研究对象发现单独喂食dsRNA无法产生有效的基因沉默，但是在利用壳聚糖、量子点CQD和脂质体Lipofectamine2000对dsRNA进行包裹后，3种载体都能有效提高靶标基因的RNAi致死效率，其中CQD的增效最好(图1)。

注：以不同载体递送dsEGFP产生的害虫死亡率(均小于10%)进行校正分析；CHI：壳聚糖，CQD：量子点CQD，LIPO：脂质体Lipofectamine2000。不同小写字母表明处理组间存在显著性差异(P<0.05，Kruskal-Wallis test)。图1 不同纳米载体复合dsG3PDH喂食的印度谷螟的校正死亡率

但是目前，基因载体在害虫RNAi中的毒力增效机理尚缺乏深入探究。在今后的研究中，一方面需要对更多的载体材料进行测试筛选；另一方面也需要对载体的增效机理进行系统性解读，助力开发具有靶标特性，高效的dsRNA递送系统。

4 结论与展望

RNAi具有高效、专一性强等优点，因此被广泛应用于储粮害虫基因功能鉴定及其防治研究中。目前dsRNA注射和饲喂在多种储粮害虫中都取得了明显的沉默效果，为RNAi技术应用于储粮害虫防治提供了理论依据。然而，目前该技术在储粮害虫防治实践中还受到RNAi效率的制约，一方面储粮害虫种类与dsRNA递送方式影响了RNAi效率，造成这种现象的原因可能包括：dsRNA胞外降解、dsRNA细胞吸收和RNAi核心机制差异等。另一方面，靶标基因与dsRNA分子设计同样也会影响基于RNAi的储粮害虫防治效率。包括脂质体、量子点和壳聚糖在内的多种基因载体可以通过提高dsRNA在害虫体液中的半衰期和细胞吸收、扩散效率，从而增强了基因沉默效果。今后的研究中还需要对RNAi靶标基因、效率决定机制及相关增效技术进行更加深入地探索，另外，RNAi应用到储粮害虫防控中还需要对其安全性以及dsRNA在粮堆中的稳定性进行系统性评价，从而促进RNAi技术在储粮害虫防控中的应用实践。