隔药灸关元穴对原发性痛经大鼠疼痛反应与血清β-EP、子宫PGE2/PGF2α、脾脏NK细胞活性的影响*

秦中银 陈盼碧 杨雯雯 金灵敏 唐徐韵 周杨嘉琪 侯天仙

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002）

原发性痛经（PD）是在女性无盆腔病理情况下出现月经疼痛［1］，其中疼痛是降低PD患者生活质量的主要原因之一［2］。在西医方面，对于PD的治疗尚无良好的方案，非甾体消炎药是治疗PD的一线药物，但有诸多副作用，临床应用范围有限［3］。中医药治疗PD起效快，不良反应小，尤其是艾灸治疗PD疗效确切［4］，在改善症状与远期治疗效果方面具有独特优势。而隔药灸是中医外治法的重要构成部分，对治疗PD有较好的镇痛效应。关元穴作为治疗PD的主穴，在治疗PD的选穴频次中排第2位［5-6］，在位置上关元穴与病位胞宫邻近，与支配子宫平滑肌的T12～L1节段交感神经有重叠［7］。临床研究证实［8-9］，隔药灸关元穴与直接灸关元穴治疗PD均具有较好疗效，但其机制尚未明确，需要进一步探讨。本实验观察隔药灸关元穴对大鼠扭体反应、血清β-内啡肽（β-EP）、子宫组织前列腺素E2（PGE2）/前列腺素F2α（PGF2α）、脾脏NK细胞活性的变化，分析隔药灸关元穴治疗PD的可能机制以及与直接灸关元穴的效应差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雌性Wistar大鼠32只，实验动物由贵州中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK-（军）2012-0011。动物安置在通风、自然光照环境，自由饮水和给食。本实验遵照国家有关动物的使用及伦理学规定。

1.2 试药与仪器 苯甲酸雌二醇由宁波第二激素厂提供［批号：（2011）lIi 0252511］；缩宫素由马鞍山丰原制药有限公司生产（批号：34020473）；艾绒与少腹逐瘀汤方药（当归∶川芎∶赤芍∶肉桂∶小茴香∶五灵脂∶没药∶生蒲黄∶延胡索∶炮姜=3∶1∶2∶1∶0.5∶2∶1∶3∶1∶1）由贵州中医药大学第一附属医院中药房自制；K 562细胞株与大鼠脾脏NK细胞分离液试剂盒、大鼠β-EP、PGE2、PGF2α酶联免疫试剂盒均购于武汉博士德生物公司（批号分别是：K2011，RATP，DRE2050，DRE20017，DRE2125）；电子天平（美国奥豪斯）；低温冰箱（青岛Haier）；离心机（法国JUOAN）；酶标仪（美国BIO-RAD）。

1.3 分组与造模 动物适应性喂养1周后按随机数字表法分为空白对照组、模型组、隔药灸关元组、直接灸关元组，每组8只。除空白对照组外，其余各组参考文献建立痛经模型［10］：持续10 d股部皮下注射苯甲酸雌二醇（第1日和第10日0.5 mg/d，第2～9天0.2 mg/d），末次注射苯甲酸雌二醇24 h后，腹腔注射2 U缩宫素制敏。空白对照同期股部皮下注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.4 治疗方法 艾炷统一由艾绒制备，每壮0.5 g；药饼用少腹逐瘀汤方药按常规成人剂量，研磨成粉末，治疗时用蒸馏水+透皮剂（氮酮）手工制成宽0.8 cm、高0.2 cm的药饼。治疗前2 d剪去大鼠“关元”穴及附近被毛，蘸涂脱毛剂，纱布拭去脱下的毛发。第11日起，将大鼠仰卧位固定在特制固定笼中，在大鼠清醒状态下进行治疗。空白对照组与痛经模型组正常饲养，均不做治疗。隔药灸关元组与直接灸关元组参照《实验针灸学》取“关元”穴，常规消毒，隔药灸关元组将药饼放置“关元”穴上，再将艾炷放置药饼上；直接灸关元组将艾炷放置“关元”穴上，点燃，两组均艾灸7壮，每日1次，连续10 d。

1.5 扭体实验 实验第21天，治疗结束30 min内，每只动物均腹腔注射缩宫素2 U，立即记录30 min内扭体次数。

1.6 标本采集与检测 扭体实验完毕后，用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射，待大鼠完全昏迷后进行样本采集。1）血清β-EP检测：将麻醉大鼠仰卧位固定于模型板，剥离股动脉，取5 mL血液离心收集上清液，置于-70℃冰箱冻存，用于检测β-EP含量。2）子宫组织PGE2、PGF2α含量检测：取血完毕后，大鼠断颈处死，迅速剖离其新鲜子宫组织，冲洗并拭干水分后精密取50 mg组织，加入提前预冷的PBS 0.5 mL，冰盒中充分研磨30 min，然后以4℃2 500 r/min离心10 min取上清液，-70℃保存，用于检测PGE2、PGF2α含量。3）MTT比色法检测各组动物脾脏NK细胞活性：无菌操作下取新鲜脾脏组织，预冷0.9%氯化钠溶液冲洗血液，滤纸拭干后精密取50 mg组织，研磨、离心与保存方法同子宫组织。用含10%牛血清的1640培养液将脾细胞悬液稀释，调至1×106/mL，靶细胞用k562（提前孵育24～48 h），调整细胞数为1×105/mL。96孔培养板用移液枪吸取效、靶细胞各100 μL，孵育30 min；效应细胞对照孔然后各滴加100 μL效应细胞、1640培养液，靶细胞对照孔各滴加100 μL靶细胞、1640培养液，每个标本3个复孔。各孔加入10 μL MTT在37℃、5%CO2培养箱条件下共同孵育4 h；孵育完成后，吸弃上清液，各孔加 DMSO 150 μL，甘氨酸缓冲液（pH 10.5）20 μL，中等速度摇床10 min。以570 nm波长的酶标仪计算各孔吸光度值，NK细胞活性计算用每个标本3个复孔测定的均值计算。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，单因素方差分析比较各组差异，进一步用LSD检验两组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况与扭体次数比较 见表1。造模前，各组大鼠饮食、行动、精神与毛发色泽一切正常。造模后，除空白对照组无变化，模型组、隔药灸关元组与直接灸关元组均出现改变，以模型组变化最为明显，食欲减退，毛发暗淡，动作迟缓。如表1所示，出现注射缩宫素后，空白对照组无扭体，模型组扭体次数较空白对照组明显增多（P<0.01），与模型组比较，两个治疗组扭体次数显著减少（P<0.01），但两个治疗组之间扭体次数差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠扭体次数及血清β-EP含量比较（±s）

表1 各组大鼠扭体次数及血清β-EP含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.01。下同。

组别空白对照组模型组隔药灸关元组直接灸关元组n 8 8 8 8扭体次数（次/30 min）0 14.00±6.92*1.70±0.67#2.20±0.49#血清β-EP（pg/mL）205.54±26.28 103.97±28.51*178.27±22.44#139.15±22.90#

2.2 各组大鼠血清β-EP含量比较 见表1。与空白对照组比较，模型组血清β-EP显著降低（P<0.01），与模型组比较，两个治疗组血清β-EP含量均明显增加（P<0.01），但两个治疗组之间β-EP含量差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 各组大鼠子宫组织PGE2、PGF2α含量比较 见表2。与空白对照组比较，模型组子宫组织PGE2显著降低（P<0.01），PGF2α明显升高（P<0.01）；与模型组比较，两个治疗组PGE2显著提高（P<0.01），PGF2α明显下降（P<0.01），但两个治疗组之间PGE2与PGF2α含量比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠子宫PGE2与PGF2α含量比较（pg/mg，±s）

表2 各组大鼠子宫PGE2与PGF2α含量比较（pg/mg，±s）

组别n PGE2PGF2α 8888空白对照组模型组隔药灸关元组直接灸关元组22.09±7.92 8.25±2.58*17.80±2.97#16.60±3.24#55.45±16.12 80.41±22.28*50.40±11.59#47.54±10.54#

2.4 各组大鼠脾脏NK细胞活性比较 见表3。如表3所示，与空白对照组比较，模型组脾脏NK细胞活性显著下降（P<0.01）；与模型组比较，两个治疗组脾脏NK细胞活性明显提升（P<0.01）；与直接灸关元组比较，隔药灸关元组NK细胞活性更高（P<0.05）。

表3 各组大鼠NK细胞活性比较（%，±s）

表3 各组大鼠NK细胞活性比较（%，±s）

注：与直接灸关元组比较，△P<0.05。

组别空白对照组模型组隔药灸关元组直接灸关元组n 888 8 NK细胞活性31.35±12.85 11.15±6.43*48.96±9.94#△34.63±6.88#

3 讨 论

痛经的主要病理变化是由于子宫平滑肌痉挛性收缩诱导子宫组织缺血缺氧导致疼痛［11］。在痛经动物模型研究中，扭体反应是一个重要指标，用于检测镇痛效应［12］。实验结果显示隔药灸关元与直接灸关元均可明显减少PD大鼠扭体次数，提示隔药灸关元与直接灸关元均可缓解PD大鼠疼痛，有较好的镇痛效应。

PG是机体重要的内分泌激素，PGE2和PGF2α是非妊娠子宫内膜合成与释放的主要激素，PGF2α可激活子宫内小动脉的PGF2α受体，刺激自主神经纤维，促使平滑肌收缩引起疼痛［13］，而PGE2抑制平滑肌自发痉挛缓解疼痛。本研究结果表明，痛经模型组较空白对照组子宫组织PGE2含量显著减少，PGF2α含量显著增加。经治疗后，隔药灸关元组与直接灸关元组的子宫组织PGE2水平明显升高、PGF2α水平明显降低，提示隔药灸关元与直接灸关元均可调控PD大鼠子宫组织中PGE2与PGF2α的合成与释放，促成子宫舒张与抑制痉挛达到止痛效果。

β-EP作为内源性镇痛作用的神经多肽，可直接靶向子宫，调节生殖内分泌系统，其含量与痛经的发生、转归有密切关系［14］，临床研究发现痛经血清中β-EP含量与患者疼痛程度呈负相关［15］。本研究表明，模型组血清β-EP含量显著降低，诱发PD大鼠疼痛产生扭体反应，而隔药灸关元组与直接灸关元组的血清β-EP含量明显升高，揭示隔药灸关元与直接灸关元均可提高血清β-EP含量达到止痛作用。而β-EP作为内源性阿片肽还可作用于NK细胞膜上的阿片受体而加强其杀伤活性来减轻疼痛［16］。NK不仅是机体重要的免疫调节细胞，同时也是子宫内膜组织主要淋巴细胞，研究显示，抑制NK细胞活性可降低疼痛阈值［17］。本研究结果显示，隔药灸关元与直接灸关元均可提高PD大鼠NK细胞活性，但隔药灸关元与直接灸关元比较，前者对NK细胞活性的影响更明显。

本实验中隔药灸是间接灸的一种类型，是结合灸法和药物作用的一种中医外治法，与同属中医外治法的直接灸常用于PD的治疗，具有较好的镇痛效应［8-9］，本研究结果与之相符。但在本研究中，隔药灸“关元”穴后，NK细胞的活性明显高于直接灸“关元”，但在神经、内分泌相关因子中两者差异无统计学意义，表明隔药灸关元对机体免疫功能的影响要优于直接灸关元。原因可能有以下方面。1）隔药灸关元组有药饼的使用，药饼的药方为少腹逐瘀汤，该方做成隔药灸的药饼，结合了灸法与药物的作用。另外在艾炷的温热刺激作用下，药物经皮质层吸收增加，在相关经穴位置酶活性升高而促进药物的吸收［18］，增强了补益气血、调经止痛的作用。相关研究也表明少腹逐瘀汤具有调节机体自身免疫的功能［19-20］。2）艾炷燃烧同时产生温热效应、光学辐射和艾烟产物，不同隔物介质对灸温存在差异性影响从而获得不同的灸效［21］。灸效也受多种因素的调控与影响，比如不同灸法、灸量等，本实验中隔药灸与直接灸属艾灸中的不同灸法，对灸效会产生不同的时效性。相关研究也揭示［22-23］，隔物灸不仅在经穴局部位置发挥作用，隔物介质还可渗透到皮下、肌层，起到改善局部微循环、提高免疫功能的作用。以上可能是隔药灸对PD大鼠NK细胞活性影响优于直接灸的原因。

综上，隔药灸关元可通过提高血清β-EP、子宫组织PGE2含量与脾脏NK细胞活性，降低子宫组织PGF2α含量起到较好镇痛作用，其中隔药灸与直接灸镇痛效应相当。本研究中隔药灸对NK细胞活性优于直接灸的结果，隔药灸对PD机体免疫功能的影响是否与隔物灸的介质参与、不同灸法、灸量与灸温等有关，将是我们下一步研究的重点。