细胞培养实验平台的管理经验探讨

马 芳 ，钱 成 ，肖风丽 ，2*

（1.安徽医科大学科研实验中心，安徽 合肥 230032；2.安徽医科大学第一附属医院皮肤研究所和皮肤科，安徽 合肥 230032）

细胞培养技术是现代生物与医学研究等领域的基础技术及基本技能，也是细胞工程、基因工程和生物医学工程的重要研究手段[1]。细胞培养室是进行细胞相关研究活动的重要场所，是生物与医学研究领域科研产出的重要平台，高效和科学的管理是细胞培养室正常运行的重要保障[2]。细胞培养室在生物与医学研究领域具有重要的地位，但由于细胞培养需要无菌操作，有别于其他实验室[3-4]，这为制定统一的细胞培养室管理标准增加了难度。目前，各大细胞培养实验平台按照无菌操作的要求并结合自身的实际情况与发展目标实现对细胞培养室的管理。安徽医科大学科研实验中心细胞培养实验平台对运行中遇到的各种管理问题进行不断探索、改善，从而积累了一些经验。本文从其实际经验出发主要探讨细胞培养室制度建设、环境管理以及安全管理等问题，并对制度建设以及环境管理进行重点阐述。

1 制度建设

1.1 准入制度

申请使用细胞培养室的学生不限专业和年级，细胞实验技能的差异性较大，如一名学生操作不当可能造成整个培养室环境污染，这是细胞培养室管理上的一个难题。为此，本平台制订了准入制度及准入流程，如图1所示。所有申请使用细胞培养室的人员均要接受培训，培训内容包括实验室安全、各项制度、细胞培养基础理论、细胞培养实际操作和仪器使用。通过理论讲解让学生初步了解细胞培养的概念、原理及应用；通过细胞培养的教学视频让学生充分了解细胞培养的操作步骤及注意事项；通过实际操作能够让学生掌握细胞培养的基本技术；在学生培训过程中，强调无菌的重要性，帮助其树立无菌观念[5]，并注重人才培养，在培训学生掌握基本实验技术的同时，注重培养学生严谨的科研思维和素养，有利于其实验的开展[5]。培训结束后的考核分理论与实际操作，考核合格后进入过渡间实习1个月，过渡间是仅用于实习的专用细胞培养室，主要目的是不影响其他人实验，并完成对考核合格者技术掌握程度的评价。实习期未违规违纪，未出现污染方能长期使用细胞培养室。

图1 细胞培养室准入流程

1.2 预约制度

本细胞培养室内的每台生物安全柜均安装有智能化预约终端，同时制定了预约制度：使用人员一般提前一天预约生物安全柜的使用时段，并简单描述实验内容，经审核通过使用。如实验开始时间前后15 min未刷开仪器或使用时间超过预约时长，或使用时长不超过预约时长的一半，系统会自动扣除个人的信用分，如能按预约完成一次实验，系统会自动加分，信用分低于一定分值将不能预约。预约制度保证了每台生物安全柜在每个时段仅一人使用，可以促使学生规划好实验流程，保证细胞培养平台高效运行，同时系统也记录学生的使用信息，以便于查询和统计。

1.3 仪器使用制度

为实现细胞培养室内仪器规范化管理，保证仪器高效运转，本平台制定了仪器使用制度，主要内容包括以下几点：（1）细胞培养箱和冰箱划分区域，不允许擅自动用他人细胞或物品；（2）培养箱与冰箱的门打开时间不能过长，必须及时关闭；（3）使用人员发现仪器故障，立即告知专责教师；（4）每天的值日生须查看气瓶压力表以及培养箱显示屏，发现异常须告知专责教师；（5）所有仪器须严格按照使用说明进行操作，不能随意更改参数；（6）实验结束后，离心机、细胞计数仪、生物安全柜和显微镜等仪器须关闭开关。

1.4 液氮罐的使用及细胞冻存制度

细胞冻存与细胞复苏是细胞培养中的关键技术，液氮罐是用来长期储存细胞最常用的设备[6]。本平台制定了液氮罐的使用及细胞冻存制度。主要内容包括以下几条：（1）液氮容量的查看以及订购由专责教师负责，保证液氮罐内始终含有足够的液氮维持细胞活力；（2）按照第几杆—第几层—第几排—第几列将液氮罐内的每一个冻存位置进行编号，同时冻存管上标记细胞名称以及时间，将冻存管放入液氮罐时一定要在存放记录本上登记每个冻存管的细胞名称、放入的具体位置、时间以及存放人等信息，方便复苏细胞时查找；（3）存取细胞时须穿戴好液氮罐室配备的专用护目镜和手套，并速存速取，防止冻存管爆炸给操作人员带来的伤害，保障操作者的安全。

2 环境管理

细胞培养室的环境对细胞培养实验有着非常关键性的影响，良好的环境对实验的顺利进行具有促进作用，不良的环境可能会导致细胞死亡或细胞污染等，不仅造成了科研资源的浪费，而且会耽误实验进程[7]。因此，细胞培养室的环境如何管理是每个细胞培养室都必须重点考虑的问题。细胞培养室的环境管理可分为细胞污染预防和细胞污染处理。

2.1 细胞污染预防

细胞污染预防主要通过环境卫生管理和仪器设备维护来实现，环境卫生管理主要是通过每日值日和定期大扫除来完成。每日值日是通过安排并监督每日的值日生对桌面、生物安全柜的台面以及各个仪器的表面进行清理并杀菌消毒；定期大扫除是定期对细胞培养室内的桌面、柜子、仪器、地面以及各死角进行清理并杀菌消毒。仪器设备维护主要是指定期检查、更换细胞培养室高效过滤系统、生物安全柜的过滤器、紫外灯管等设备配件，以及定期检查液氮罐和超低温冰箱等细胞存储设备，确保设备能够正常运行[3]。

2.2 细胞污染处理

细胞污染是指混入细胞培养环境中，对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物[8]。学生在进行细胞培养实验时，可能因操作不规范或实验物品灭菌不彻底等造成细胞污染[9]。轻则导致污染细胞废弃，重则连带污染培养箱内其他细胞甚至整个实验室环境，给科研工作带来严重的损失和威胁[10]。因此，了解细胞污染类型并及时进行检测鉴别，从而清除污染，是成功培养细胞的重要因素。本平台针对细菌污染[11]、真菌污染[10]、支原体污染[12]、“黑胶虫”污染[13]这4类常见的细胞污染总结了较为实用的检测鉴别方法和清除步骤，见表1。

表1 细胞污染鉴别与清除

3 安全管理

细胞培养室存在多种危险因素，除常见的几种（如消防水电、危险化学品和有毒有害废弃物）以外，还包括高压灭菌锅、紫外线、液氮、二氧化碳气瓶等。这些危险因素如若管理不当可能造成人员伤亡、仪器设备损坏及环境污染。为了实验操作人员的人身安全、仪器设备安全以及环境保护，细胞培养室必须加强安全管理。针对以上危险因素，细胞培养室的管理人员须定期检查电路、水管及仪器状态，及时消除安全隐患[14]；危险化学品须储存于危化柜中，其存取由专人管理，并做好相关登记；实验人员须及时按照相关的规定对实验废弃物进行无害化处理，避免造成人员感染和环境污染；高压灭菌锅的操作人员须通过特种设备培训，并持有相关证书；禁止使用年检不合格的高压灭菌锅；紫外灯照射时间须控制在适当范围，既能杀菌消毒，也能避免产生过多臭氧而危害实验人员健康；细胞冻存和复苏须遵守以上“液氮罐的使用及细胞冻存制度”，避免液氮给操作人员造成的伤害；二氧化碳气瓶须置于气瓶固定架，并将安全链条扣好，防止气瓶倾倒、喷射以及爆炸等造成事故。