桦褐孔菌与其固体发酵物对2型糖尿病大鼠的氧化应激损伤作用

王 欢，王丽莹，刘俊泽，唐 敏，陈长宝，王淑敏

（长春中医药大学，吉林长春 130117）

近年来，随着社会的发展、科学的进步，人们对大型真菌的研究越来越深入，发现许多大型真菌具有很好的药用价值，长期以来蘑菇（大型真菌）作为功能性食品和药品被人们广泛应用和认可[1−4]，例如灵芝、桑黄、冬虫夏草、黑木耳、香菇、灰树花、茯苓等真菌，而桦褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát是最具发展前景的药用真菌之一[5−6]。桦褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát，又名白桦茸、树蘑菇、西伯利亚灵芝等，有“森林钻石”的美誉，隶属锈革孔菌科，褐卧孔菌属。在外文文献中，学名常以Inonotus obliquus、Fuscoporia oblique出现。俗名为Birch mushroom、Black Birch touchwood、茶卡（Чага）等[7−8]。主要分布于俄罗斯、中国、日本、北欧的波兰和荷兰等国家[9−13]，早在16世纪初期，世界上就开始有人食用桦褐孔菌来用于治疗糖尿病、肿瘤、肝病、胃病等[14−17]，同时，还具有免疫调节、抗疲劳抗炎、抗病毒等生物活性[18−21]，因此桦褐孔菌有着悠久的历史应用背景。近年来，我国对食药用研究十分重视，桦褐孔菌的相关研究炙手可热，但由于桦褐孔菌的生长环境和生长年限的限制，桦褐孔菌在自然环境下生长多年才能获得较大菌核，野生资源十分珍贵，这使得桦褐孔菌药理活性和药效研究没有得到更好的发展。

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一类以持续高血糖和血脂异常为主要特征的代谢类疾病。文献中广泛的报道了炎症反应与糖尿病密切相关，TNFα是一种主要由单核巨噬细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，可诱导IL-1、IL-6的合成[22]。近年来研究发现，TNF-α可抑制胰岛素信号以及胰岛素调节下的葡萄糖的摄取，表明胰岛素抵抗的发生可以由TNF-α介导产生[23]。戚琛晔等[24]发现氧化应激反应与糖尿病存在密切相关，氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。超氧化物歧化酶SOD，是一种源于生命体的活性物质，能够迅速清除线粒体呼吸链电子传递过程中产生的超氧阴离子自由基，减轻机体氧化应激状态，保护细胞免受损伤。细胞脂质过氧化程度可以用丙二醛（MDA）的含量高低表示，MDA含量的降低可能意味着机体对抗氧化损伤能力增强[25−26]。

因此，研究组利用固体发酵技术对桦褐孔菌进行了深入研究，并比较了桦褐孔菌（菌粉）、桦褐孔菌水提物、固体发酵物（菌粉）、固体发酵物水提物对高糖高脂饮食+STZ诱导的2型糖尿病大鼠体重、血糖、口服糖耐量及机体炎症和氧化应激水平的影响。本研究不但缓解了桦褐孔菌野生资源匮乏的问题，同时，评价了固体发酵物是否具有代替野生桦褐孔菌的潜力，并且对比了经过提取和直接灌胃菌粉的药理作用差别，为进一步研究其药理作用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桦褐孔菌 采自长白山，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为桦褐孔菌Inonotus obliquus（Pers.）Pilát），标本现保存于长春中医药大学，固体发酵产物由吉林省菌物药生物技术工程实验室提供；STZ 美国Sigma 公司；二甲双胍 中美上海施贵宝制药有限公司；TNF-α，IL-6，IL-1β，MDA，SOD酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒 上海源叶生物技术有限公司；110只雄性SD大鼠（180~220 g） 辽宁长生生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（辽）2015-0001，合格证编号：NO.2110023000118343。

TYS-200高速多功能粉碎机 浙江永康市红太阳机电有限公司；恒温水浴锅 常州市江南实验仪器厂；AUY220分析天平 岛津国际贸易上海有限公司；酶标仪 Rayto RT-6000；TGL16M台式高速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；血糖仪三诺生物传感股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的提取 以薏米:麦麸:桦树汁=2:1:8为最佳发酵基质，在30 ℃条件下对桦褐孔菌进行固体发酵，得到固体发酵产物。取桦褐孔菌2.0081 g，固体发酵产物2.0104 g，加8倍量的水浸泡30 min，煎提3次，每次30 min，合并3次水煎液，浓缩，水浴蒸干，得桦褐孔菌水提物0.2607 g，桦褐孔菌固体发酵产物水提物0.6112 g。即桦褐孔菌的出膏率为12.98%，桦褐孔菌固体发酵产物的出膏率为30.40%。

1.2.2 分组及给药 SD大鼠随机分为11组，每组10只：空白组（生理盐水）；模型组；阳性药组（二甲双胍，0.2 g/kg）；桦褐孔菌水提物（WIO）组（0.4、0.8 g/kg）；桦褐孔菌菌粉（IO）组（3.08、6.16 g/kg）；固体发酵物水提物（WSFIO）组（0.4、0.8 g/kg）；固体发酵物（SFIO）组（1.3、2.6 g/kg）。

1.2.3 造模 SPF级大鼠，雄性，随机选取10只作为正常对照组，常规饲料喂养，其他大鼠喂养高脂高糖饲料6周，6周后单次小剂量腹腔注射STZ（50 mg/kg）诱导2型糖尿病模型（1% STZ溶解在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mmol/L，pH4.4）中，在半小时内注射完），空白组以同样的方式腹腔注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，一周后，禁食但不禁水，尾静脉取血，血糖试纸测定空腹血糖值FBG，其中FBG≥7.8 mmol者为Ⅱ型糖尿病模型成功[27−28]。

1.2.4 口服糖耐量实验（OGTT） 造模过程中每周记录大鼠体重变化。实验结束前，禁食24 h但不禁水，尾静脉取血后应用血糖仪测定并记录血糖值即空腹血糖值FBG，以获得基线血糖水平。随后，各组大鼠灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg），灌胃后采用血糖仪分别在0、30、60、90、120 min测定并记录血糖值[29]。

1.2.5 生化指标检测 给药结束后，迅速收集血清，采用ELISA试剂盒测定大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、SOD和MDA的水平，评价桦褐孔菌及其固体发酵物对糖尿病大鼠机体氧化应激及炎症反应的影响。

1.3 数据处理

本实验采用GraphPad Prism 8.0软件统计和作图。所有数据均以“均值±标准差”表示。通过单因素方差分析与Tukey多重比较检验比较组间差异。P<0.05表明具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 桦褐孔菌对糖尿病大鼠体重的影响

由表1可知，从第5周开始，SD大鼠开始出现“三多一少”表现，与空白组比较，模型组大鼠体重显著降低（P<0.001）。给药后，与模型组比较，IO低高剂量组大鼠体重第5周开始显著升高；WIO低剂量组第10周开始显著升高（P<0.01）；WSFIO高剂量组第9周开始显著升高（P<0.05），且优于阳性药组。研究表明，桦褐孔菌菌粉及其水提物和固体发酵水提物均能显著增加糖尿病大鼠体重，缓解体重持续减轻问题。

表1 桦褐孔菌对糖尿病大鼠体重的影响（x¯±s, g, n=10）Table 1 Effects of I. obliquus on body weight of the diabetic rats (x¯±s, g, n=10)

2.2 对大鼠口服糖耐量的影响

由表2可知，葡萄糖灌胃后，血糖开始逐渐升高，30~60 min后开始下降，与空白组比较，模型组大鼠血糖显著升高（P<0.001），与模型组比较，阳性药组和桦褐孔菌各给药组血糖值均有降低的趋势，SFIO 1.3 g/kg和SFIO 2.6 g/kg在葡萄糖灌胃30 min后显著降低（P<0.01；P<0.05），分别降低了29.1%和25.4%，张等[30]的研究表明，桦褐孔菌总多糖（400、800 mg/kg）给药两周后血糖分别降至18. 97和12.66 mmol/L，而本研究中的给药组均可达到近似或更优效果，提示桦褐孔菌固体发酵物能相对较好地改善大鼠口服糖耐量，效果优于其他给药组。

表2 桦褐孔菌对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响（x¯±s, mmol/L, n=10）Table 2 Effects of I. obliquus on oral glucose tolerance of the diabetic rats (x¯±s, mmol/L, n=10)

2.3 桦褐孔菌对糖尿病大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的影响

由表3可知，给药 8 周后，与空白组比较，模型组大鼠血清中炎症因子 IL-6的水平极显著升高（P<0.01），与模型组相比，阳性药组可显著降低血清中IL-6的含量（P<0.05），桦褐孔菌各给药组在不同程度上可降低血清中IL-6的水平，但无显著性差异（P˃0.05）。

表3 桦褐孔菌对糖尿病大鼠血清中IL-6，IL-1β，TNF-α水平的影响（x¯±s，n=10）Table 3 Effects of I. obliquus on IL-6，IL-1β and TNF-α levels in serum of the diabetic rats (x¯±s, n=10)

与空白组比较，模型组大鼠血清中炎症因子IL-1β的水平显著升高（P<0.05），与模型组相比，阳性药组、WIO 低高剂量组、WSFIO 低剂量组均可显著降低血清中IL-1β的水平（P<0.05）。

与对照组比较，大鼠血清中炎症因子TNF-α的水平极显著升高（P<0.01），与模型组相比，阳性药组、IO 低高剂量组、WIO低剂量组、SFIO 低高剂量组和WSFIO 高剂量组均可显著降低血清中TNF-α的水平。

2.4 桦褐孔菌对糖尿病大鼠血清中SOD和MDA的影响

由表4可知，给药 8 周后，与空白组比较，模型组大鼠血清中SOD的水平极显著降低（P<0.001），与模型组相比，阳性药组和桦褐孔菌各给药组在不同程度上均可显著提高血清中SOD的水平（P<0.05，P<0.001或P<0.001）。结果不难看出，水提后得到的提取物的SOD水平较直接菌粉给药均有所降低。

与空白组比较，模型组大鼠血清中丙二醛MDA的水平显著升高（P<0.001），与模型组相比，阳性药组和桦褐孔菌各给药组均可降低血清中MDA的水平（P<0.01或P<0.001）。提示桦褐孔菌固体发酵物具有较好的抗氧化活性。

3 结论

本研究研究了桦褐孔菌及其固体发酵物对2型糖尿病大鼠机体的保护作用，结果表明，桦褐孔菌子实体及其固体发酵产物可以降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，显著上调SOD的含量、降低MDA的含量，改善氧化应激反应，改善糖尿病大鼠口服糖耐量，抑制糖尿病大鼠体重的减轻，揭示桦褐孔菌固体发酵物具有良好的抗炎及抗氧化活性。

直接以菌粉、固体发酵物或二者的水提物给药对各个指标的影响不一，水提与直接粉碎（菌粉）给药结果有一定差异，对体重减轻的改善桦褐孔菌菌粉（IO）优于其水提物（WIO），WSFIO高剂量组优于SFIO组；固体发酵物SFIO组对口服糖耐量的调节优于其他给药组；WIO低、高剂量组和WSFIO高剂量组对IL-1β的降低作用优于其他给药组；IO低、高剂量组，WIO 低剂量组，SFIO低、高剂量组和WSFIO高剂量组对TNF-α的抑制作用优于其他剂量组；各给药组均可提高SOD的水平，其中IO、SFIO和WSFIO组效果基本相当，且优于WIO组；各给药组均可抑制MDA的水平，其中IO、WIO和WSFIO组效果基本相当，且优于SFIO组。总体来说，固体发酵物具有代替野生桦褐孔菌改善2型糖尿病的炎症及氧化应激潜能，其发酵工艺也需要进一步深入研究。