盐胁迫对不同时期盐地碱蓬组分含量的影响

孟 然，杨雅华，李赵嘉，王秀萍，薛志忠

（河北省农林科学院滨海农业研究所，唐山市植物耐盐研究重点实验室，河北唐山 063200）

随着生态环境的恶化，盐渍化土壤成为农业发展面临的重要问题之一，严重制约着农作物的生长发育，对农业生产造成很大的威胁，导致土壤退化，土地利用率降低。盐生植物是一类能够在盐碱化程度较高的土壤中生长的植物，不仅对盐碱地区的土壤、气候等环境条件具备很强的适应性，而且可对土壤起到积极的修复作用，增加土壤养分含量、降低土壤中重金属含量等[1−2]。

盐地碱蓬〔Suaeda salsa（L.）Pall.〕又名翅碱蓬，俗名黄须菜，为藜科碱蓬属一年生草本盐生植物[2]，一般生于盐碱荒地上，耐盐性极强，是盐碱地的典型指示植物[3]。盐地碱蓬幼芽鲜嫩可以食用，含有蛋白质、维生素、膳食纤维、脂肪酸、矿物质、黄酮类化合物等化学成分[4]，其中维生素尤以抗坏血酸含量最为突出，最高可达到822 μg/g，与蔬菜中含量较高的辣椒几乎相当，可作为野生蔬菜中较好的抗坏血酸来源[5]；蛋白质与膳食纤维共同占干物质总量的30%以上[4]；氨基酸含量丰富，种类齐全，必需氨基酸构成合理[6]，是一种极具营养价值的野菜，被誉为“菜中灵芝”[7]，也是盐碱地区家家户户常食野菜之一。

亚硝酸盐超标已经成为影响食品安全的重要原因之一，由于生长环境的特殊性，盐地碱蓬等野菜中亚硝酸盐含量显然成为一项重要监测指标。现有文献多记载山东盐城、东营及山西汾河滩地区碱蓬亚硝酸盐情况，不同地区碱蓬亚硝酸盐含量存在较大差异，部分亚硝酸盐含量超过了联合国粮食农业组织/世界卫生组织规定和中国食品安全国家标准（亚硝酸盐含量≤20 mg/kg）[8]。当前，随着对盐地碱蓬作为优质的蔬菜、经济作物和具有医疗保健价值属性的充分认识，盐地碱蓬资源的开发引起人们的重视，但缺少对品质控制较为系统的研究。

本试验以盐地碱蓬为研究对象，考察了不同浓度盐胁迫处理对不同生长时期的盐地碱蓬水分、蛋白质、氨基酸、抗坏血酸、亚硝酸盐和总黄酮含量的影响，了解盐地碱蓬的耐盐性；利用优化后的盐地碱蓬总黄酮提取方法对盐地碱蓬总黄酮含量进行测定，以期为盐地碱蓬栽培提供技术支撑，为其总黄酮的提取及产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

曹妃甸沿海地区野生的盐地碱蓬〔Suaeda salsa（L.）Pall.〕 2019年3月17日播种，于苗期、花期、结果期（每段时期的第10 d分别取样）选取生长良好的植株采集地上部分10 cm作为待测样本；芦丁标准品（批号：R701800） 德国Dr.Chemical有限公司；纤维素酶（货号：C805042，10000 U/g）、果胶酶（货号：P816736，30000 U/g） 上海麦克林生化科技有限公司；磷酸、甲醇色谱醇 Fisher Chemical公司；无水乙醇、草酸、抗坏血酸、碳酸氢钠、2,6-二氯酚靛酚 分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；氨基酸含量检测试剂盒（货号：BC1570）、亚硝酸盐含量测定试剂盒（货号：BC1490）、双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒（货号：BC3180） 北京Solaibio科技有限公司；水为屈臣氏纯净水。

AP124W电子天平 岛津公司；JT-1027HTD机械超声波清洗机 深圳市洁拓超声波清洗设备有限公司；D-37520 osterode台式高速冷冻离心机 Biofagestratos公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HH-6数显恒温水浴锅 上海力辰邦仪器科技有限公司；SCIENTZ-48组织研磨机 宁波新芝生物科技股份有限公司；1200型高效液相色谱仪 Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 盐胁迫处理方法 试验在河北省农林科学院滨海农业研究所滨海农业综合试验基地地下式水泥池内进行。为保证盐胁迫后各项指标检测结果的准确性，采用宁亚茹和李赵嘉等[9−10]的自吸水装置进行盐胁迫处理，土壤盐度梯度分别设定为0.30%、0.60%、0.90%、1.20%共4个处理，以低盐渍土（含盐量为0.10%）为对照CK。每个处理设6盆重复，每盆8株。经盐胁迫处理后于苗期、花期、结果期分别取样测定各组分含量。

1.2.2 组分测定 将每一份盐地碱蓬样本分成两部分，一部分留用鲜样待测，一部分用流动水洗去表面泥沙，再用蒸馏水冲洗3~4次，自然阴干，烘干后粉碎过100目筛，粉末备用。

1.2.2.1 基本营养成分含量的测定 水分、抗坏血酸、蛋白质、氨基酸含量采用鲜样测定。水分含量测定：参照GB 5009.3-2016食品安全国家标准食品中水分的测定——直接干燥法[11]；抗坏血酸含量测定：参照GB 5009.86-2016《食品安全国家标准-抗坏血酸的测定》——2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]。

蛋白质含量测定：双缩脲法蛋白质含量检测试剂盒法。蛋白质（mg/g 质量）=C标准管/（A标准管−A空白管）×（A测定管−A空白管）×V样总/W。式中，C标准管：5 mg/mL；A标准管：标准管的吸光值；A空白管：空白管的吸光值；V样总：样本总体积，1 mL；W：样本质量，g。

氨基酸含量测定：氨基酸（AA）含量检测试剂盒法。氨基酸含量（μmol/g 质量）=[C标准管×V标准管×△A测定管/△A标准管]×（V样总/V样）/W。式中，C标准管：标准品浓度，10 μmol/mL；V标准管：反应体系中加入标准品体积，0.05 mL；V样总：样本总体积，1 mL；V样：反应体系中加入样本体积，0.05 mL；W：样本质量，g。

1.2.2.2 亚硝酸盐含量的测定 亚硝酸盐含量测定：食品中亚硝酸盐含量检测试剂盒法，采用鲜样测定。亚硝酸盐含量（μmol/g 质量）=0.12×[（A样品−A空白）/（A标准−A空白）]/W。式中，A样品：测定管的吸光值；A空白：空白管的吸光值；A标准：标准管的吸光值；W：样本质量，g。

1.2.2.3 总黄酮含量的测定 采用超声波辅助甲醇提取法提取盐地碱蓬总黄酮[13]，称取0.25 g盐地碱蓬茎叶干燥样品（料液比1:100 g/mL）置于容量瓶中，加入5 mL混合酶（0.1%纤维素酶+0.1%果胶酶）溶液；于60 ℃水浴30 min，容量瓶中根据甲醇浓度计算用量，加入无水甲醇将醇浓度调至70%，最后用70%甲醇溶液定容；超声120 min，超声功率360 W，水温60 ℃；利用一次性注射器和一次性0.45 μm针头式过滤器将最终提取液注入至进样瓶中备用，待进样检测。

选取超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、料液比（D）为主要评定因素进行考察，各因素的水平设定如表1。

表1 L16（44）正交试验因素水平表Table 1 L16(44) level table of orthogonal test factor

参考郭丽霞[14]的方法并有所修改，以芦丁标准品制作标准曲线，以峰面积定量，对不同盐浓度胁迫处理、不同生长时期的盐地碱蓬提取液进行HPLC分析，利用标准曲线法，通过回归方程对样品中的总黄酮（以芦丁计）进行定量分析。HPLC条件：色谱柱：Dikma C18柱（4.6 mm×250 nm，5 μm）；流动相：A（体积分数0.2%的磷酸水溶液）：B（甲醇）=50:50；检测波长：350 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。流动相均经真空泵过滤除杂和超声清洗机脱气。

1.3 数据分析

试验所得数据采用SPSS Statistics 23.0统计软件进行描述性分析，分析各指标的均值、极值、标准差和变异系数，并进行one-way ANOVA方差分析，运用Duncan检验法对品质指标含量分别进行显著性评价，P<0.05认为结果差异显著。

变异系数（CV）=（标准差/平均值）×100%。标准差=其中x¯=样本的平均值，n=样本的数量，xi=样本的个体（i=1,2···n）。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对盐地碱蓬各组分变异程度的影响

图1 为不同生长时期不同盐胁迫的盐地碱蓬各组分变异系数比较，由图1可知，水分含量变异系数最低，亚硝酸盐变异系数处于最高值。说明水分含量差异性最小，亚硝酸盐差异性最大，盐胁迫对水分含量影响不明显，对亚硝酸盐含量具有明显影响。苗期、花期和结果期水分含量的变异系数分别为5.58%、4.33%和2.30%，其中苗期水分含量变异系数最大，结果期变异系数最小，说明水分含量变化在苗期比结果期更明显。亚硝酸盐含量在三个时期中变异系数大小排名为：苗期、结果期、花期，其中苗期变异系数最大，达95.76%，花期变异系数最小，说明亚硝酸含量在苗期变化比花期更明显。同样，苗期抗坏血酸和黄酮含量的变异系数最高，结果期氨基酸和蛋白质含量变异系数显示最高值。综上，盐分对苗期盐地碱蓬水分、亚硝酸盐、抗坏血酸和黄酮含量影响较大，对结果期氨基酸和蛋白质含量影响较大。

图1 不同生长时期盐胁迫下盐地碱蓬指标变异系数Fig.1 Coefficient of variation of the indicators of Suaeda salsaunder salt stress in different growth periods

2.2 盐胁迫对不同时期盐地碱蓬水分含量的影响

一般情况下，盐胁迫会影响植物营养品质变化，但因种类、盐胁迫程度和生长时期不同，影响有所差异。由图2可知，三个生长时期相比较，苗期盐地碱蓬水分含量最高，除0.30%组外，与花期、结果期结果差异显著（P<0.05）；且在0.30%和0.60% NaCl浓度时，花期与结果期水分含量差异显著（P<0.05）。随土壤NaCl浓度增加，苗期盐地碱蓬水分含量呈持续上升的趋势，当NaCl浓度为1.20%时，水分含量达到最大值93.71%，较对照差异显著（P<0.05），增加了13.30%。由此可知，在试验所设定的土壤NaCl浓度下，促进了其茎叶含水量的增加，植株细胞内水分存在状态相对平衡稳定，生命活动正常。因此，盐胁迫有利于提升苗期盐地碱蓬水分含量。在0.30% NaCl浓度时，花期盐地碱蓬水分含量达最大值80.22%，与对照组及其他浓度相比具有显著性差异（P<0.05），而其他四组之间并无显著差异（P>0.05）。这说明施加一定浓度的盐处理更有利于花期盐地碱蓬水分含量的增加，提高其保水能力，而盐胁迫浓度过高（大于0.30%），水分吸收和叶片保水能力都会减弱，从而抑制了水分含量的增加。随土壤NaCl浓度增加，结果期盐地碱蓬水分含量呈先下降后上升的趋势，在0.90% NaCl浓度时水分含量最低，为68.68%，与对照组呈显著差异（P<0.05），降低了5.43%；1.20%NaCl浓度时水分含量略有上升，但与对照组、最低值差异均不显著（P>0.05），也就是说盐胁迫对结果期的盐地碱蓬水分含量影响不明显。

图2 盐胁迫对盐地碱蓬水分含量的影响Fig.2 Effect of salt stress on thecontent of water of Suaeda salsa

2.3 盐胁迫对不同时期盐地碱蓬抗坏血酸含量的影响

如图3所示，抗坏血酸含量随盐分梯度增加呈总体下降趋势，低浓度（小于0.60%）盐胁迫处理下，苗期盐地碱蓬抗坏血酸含量高于其他生长时期。在0.90% NaCl处理下，苗期盐地碱蓬抗坏血酸含量具有最低含量值，为2.55 mg/100 g FW，较对照组差异显著（P<0.05），降低了45.40%。大于0.30% NaCl浓度时，花期盐地碱蓬抗坏血酸含量与对照组具有显著差异（P<0.05），说明苗期和花期盐地碱蓬抗坏血酸含量对盐胁迫较敏感。在0.90%与1.20% NaCl处理下，结果期盐地碱蓬抗坏血酸含量显著低于对照组（P<0.05），分别下降了17.21%和26.23%。是由于盐胁迫等逆境加速活性氧的生成，并在体内积累造成氧化伤害，植物体内的抗坏血酸参与活性氧代谢，增强抗逆能力[15]，因此，随盐胁迫程度增加，抗坏血酸含量有所减少。

图3 盐胁迫对盐地碱蓬抗坏血酸含量的影响Fig.3 Effect of salt stress on the content of ascorbic acid of Suaeda salsa

2.4 盐胁迫对不同时期盐地碱蓬蛋白质含量的影响

图4 为不同盐分处理下不同生长时期盐地碱蓬蛋白质含量变化情况，由图可知，不同盐分组的苗期、花期及结果期碱蓬蛋白质含量均差异显著（P<0.05），花期的盐地碱蓬中蛋白质含量最高，结果期含量最低。

图4 盐胁迫对盐地碱蓬蛋白质含量的影响Fig.4 Effect of salt stress on the content of protein of Suaeda salsa

盐地碱蓬蛋白质含量在不同生长时期随盐分梯度增加呈现总体波动下降的趋势。在0.60% NaCl处理下，苗期、花期和结果期盐地碱蓬蛋白质含量均为最高，分别为27.95、45.58和19.34 mg/g鲜重（FW），较对照组差异不显著（P>0.05）；当NaCl浓度大于0.60%时蛋白质含量下降，在1.20% NaCl浓度时显著低于对照组（P<0.05）。一般认为，盐胁迫会增强植物细胞中的蛋白质合成代谢活动，从而增强渗透调节，促进植物适应盐胁迫环境[16]，当盐胁迫超过一定水平会影响到细胞膜的保护作用，进而抑制细胞内正常的生理反应，改变植物体自身的渗透胁迫和离子效应功能[17]。王昊等[18]的研究表明，随着NaCl浓度的升高翅碱蓬中蛋白质和抗坏血酸含量呈先增加后减少的趋势。与本研究结果大致相同，因此，当高浓度（大于0.60%）盐胁迫时，会通过抑制蛋白质的合成和积累来适应逆境。

2.5 盐胁迫对不同时期盐地碱蓬氨基酸含量的影响

盐胁迫会诱导植物启动自身物质代谢的变化调节，其中氨基酸的渗透调节作用在提高植物耐盐性中起重要作用[19]。如图5所示，结果期的盐地碱蓬氨基酸含量最高，除0.60% NaCl浓度组以外，与其他生长时期差异显著（P<0.05）。

图5 盐胁迫对盐地碱蓬氨基酸含量的影响Fig.5 Effect of salt stress on the content of amino acid of Suaeda salsa

苗期与花期盐地碱蓬氨基酸含量在受到盐胁迫后的响应趋势基本一致，在NaCl浓度为0.30%时，苗期和花期的盐地碱蓬氨基酸含量最低，均较对照组差异显著（P<0.05），分别降低了51.27%和32.03%；在NaCl浓度为0.60%时，花期盐地碱蓬氨基酸含量最高，为134.26 μmol/g FW，显著高于对照组（P<0.05）。

随NaCl浓度增加，结果期盐地碱蓬氨基酸含量先下降再上升，当NaCl浓度在0.60%时，结果期的盐地碱蓬氨基酸含量具有最低值，显著低于对照组及其他试验组（P<0.05），当NaCl浓度在1.20%时达到最高值，为312.96 μmol/g FW，显著高于对照组及其他试验组（P<0.05），试验结果与盐处理下番茄嫁接苗叶片和根系中总氨基酸含量显著提升[20]的研究结果一致，表明盐分在一定程度上可促进盐地碱蓬氨基酸的形成和积累，在缓解盐胁迫伤害中起重要的渗透调节作用。

2.6 盐胁迫对不同时期盐地碱蓬亚硝酸盐含量的影响

亚硝酸盐作为蔬菜食用安全性的重要指标，根据国家食品安全标准（GB 2762-2017），含量应该在20 mg/kg[8]范围以内。由图6可知，所有盐地碱蓬亚硝酸盐含量均符合国家标准，其中花期盐地碱蓬亚硝酸盐含量最低，均低于1.20 mg/kg FW，而且随NaCl浓度的增加变化幅度不明显。随NaCl浓度增加，苗期盐地碱蓬亚硝酸盐含量呈先上升再下降的趋势，在0.30% NaCl浓度时，亚硝酸盐含量上升幅度极小，较对照组差异不显著（P>0.05）；在0.90% NaCl浓度时含量最高，为7.09 mg/kg FW，显著高于对照组及其他试验组（P<0.05），当NaCl浓度在高于0.90%后，亚硝酸盐含量随NaCl浓度增加有所减少。结果期的盐地碱蓬亚硝酸盐含量随NaCl浓度增加总体有下降的趋势，在NaCl浓度为1.20%时亚硝酸盐含量最低，较对照组及其他试验组差异显著（P<0.05）。不同生长阶段盐地碱蓬中亚硝酸盐的差异性可能受到植物在不同生长期对氮元素吸收能力的内部因素以及温度、水分等外部环境的影响。

图6 盐胁迫对盐地碱蓬亚硝酸盐含量的影响Fig.6 Effect of salt stress on the content of nitrite of Suaeda salsa

2.7 盐胁迫与盐地碱蓬总黄酮含量

2.7.1 盐地碱蓬总黄酮提取工艺优化 总黄酮提取条件正交试验结果见表2，可以看出提取总黄酮的最佳工艺有两个，分别是理论最优方案为A2B3C2D4和实际最优方案试验号6（A2B2C1D4）。A2B2C1D4提取方法得到总黄酮含量为2.35%，其提取含量大于方案A2B3C2D4的提取含量（2.27%）。因此，最优方案A2B2C1D4总黄酮的提取含量最高，即超声功率500 W，超声温度70 ℃，超声时间25 min，料液比1:60 g/mL。

表2 L16（44）正交试验回归结果Table 2 L16(44) The results of orthogonal test regression

2.7.2 HPLC法测定总黄酮含量 HPLC法具有操作简单、灵敏度高、准确度高等特点，同时芦丁和总黄酮含量作为指标具有直线相关性，铝盐络合比色法测定总黄酮含量与HPLC法测定芦丁含量均可单独应用于成分提取的过程监测[21]。本研究采用HPLC法，测定盐胁迫下盐地碱蓬总黄酮含量，并且以芦丁标准品建立标准曲线，得出计算方程，以便于定量分析盐地碱蓬中总黄酮含量。回归方程为y=15467x+1.9（R2=0.997），其中y是总峰面积，x是样品中总黄酮浓度（以芦丁计），mg/mL。HPLC法得到盐地碱蓬的液相出峰图谱（以CK苗期样品为例）见图7。

图7 CK苗期盐地碱蓬总黄酮峰图Fig.7 Peak diagram of total flavonoids of Suaeda salsa at CK seedling stage

2.7.3 盐胁迫对不同时期盐地碱蓬总黄酮含量的影响 黄酮类化合物是适应性反应系统，在植物代谢过程中参与植物生态防御，并担当生殖过程的信使，可以通过调节黄酮类化合物的合成和积累来应对不同的逆境[22]。如图8所示，花期的盐地碱蓬总黄酮含量最高，达3.68%，在不同盐胁迫处理下均与苗期差异显著（P<0.05）。李岩等[23]的研究表明翅碱蓬总黄酮含量在花期达到最大（14.37 mg/g）。同时，Zhong[24]的试验也显示盐地碱蓬总黄酮的含量在9月最高（67.75 mg/g），不同月份的盐地碱蓬中总黄酮含量差异显著，与本研究结果一致。

图8 盐胁迫对盐地碱蓬总黄酮含量的影响Fig.8 Effect of salt stress on the content of total flavonoid of Suaeda salsa

盐地碱蓬总黄酮含量随梯度盐分增加呈波动上升趋势，在0.90% NaCl处理下，苗期和花期盐地碱蓬总黄酮含量为最高，分别为1.58%和3.68%，较对照组差异显著（P<0.05）。在1.20% NaCl浓度时，结果期盐地碱蓬总黄酮含量具有最高值3.16%，显著高于对照组（P<0.05）。在受到外界不利环境影响时，很多植物通过提高体内抗氧化物质含量来减轻胁迫引发的活性氧伤害，使其迅速适应盐胁迫，从而一定浓度盐分胁迫促进了黄酮化合物的合成[25]。本研究中盐地碱蓬总黄酮含量与文献中试验规律不完全相同[9,26]，其原因可能是植物的耐盐机理不同从而展现出不同的规律。

3 结论

不同生长时期的盐地碱蓬组分含量存在明显差异，其中水分含量差异性最小，亚硝酸盐差异性最大。苗期盐地碱蓬水分含量最高，且随盐胁迫程度增加呈上升趋势，在1.20% NaCl处理下达最大值，且与对照间存在显著差异（P<0.05）。抗坏血酸含量随盐胁迫程度增加总体呈下降趋势，低浓度（小于0.60%）盐胁迫处理下，苗期抗坏血酸含量最高。蛋白质含量在不同生长时期随盐胁迫程度增加呈总体波动下降趋势，花期盐地碱蓬蛋白质含量最高，在0.60% NaCl处理下为最大值。花期盐地碱蓬亚硝酸盐含量最低，在0.60% NaCl处理下显著低于对照组及其他试验组（P<0.05）。结果期盐地碱蓬氨基酸含量最高，随盐胁迫增加先下降再上升，在1.20%NaCl处理下达最高值，显著高于对照组及其他试验组（P<0.05）。采用正交试验得到总黄酮优化的提取条件：超声功率500 W，超声温度70 ℃，超声时间25 min，料液比1:60 g/mL，在0.90% NaCl处理下，花期的盐地碱蓬总黄酮含量最高，达3.68%。

综上所述，本研究优化形成了一套提取和检测盐地碱蓬总黄酮含量的方法，探究了不同浓度盐胁迫对不同生长时期的盐地碱蓬组分含量的影响，明确了适宜发展优质安全盐地碱蓬的土壤盐分范围，为盐地碱蓬质控栽培和合理开发提供技术支撑和理论依据。盐地碱蓬为强耐盐植物，可进一步增加盐胁迫的浓度，探究高盐分对各组分的影响，对于不同盐胁迫处理的不同时期盐地碱蓬中黄酮类化合物的种类以及耐盐性差异的机理有待进一步研究。