高温高压处理对花生致敏蛋白Ara h1及其免疫反应性的影响

李颖超，赵 良，钱 和

（1.常州工程职业技术学院，江苏常州 213164；2.江南大学，江苏无锡 214122）

花生由于其营养丰富、口感香浓被泛应用于食品加工，然而花生也是世界卫生组织公布的8大食物致敏原之一，且其致敏性不同于牛奶、鸡蛋等，往往伴随患者终生[1−4]。目前，国际公认比较有效的方式是避免致敏原的摄入，然而有调查结果显示，高达75%的消费者因为偶然因素摄入花生蛋白而造成过敏[5]。另外，在食物过敏引起的死亡病例中，过半由花生引起[6−7]。因此，降低花生中致敏蛋白的含量或其致敏原性，对于保护消费者免于遭受过敏性疾病具有重要现实意义。

热加工被普遍应用于食品的加工和烹饪过程，且诸多研究表明，不同的热加工处理会显著影响花生致敏蛋白的特性[8−10]。水煮后花生致敏蛋白免疫反应性下降[8−10]，而烘焙和油炸可能会产生新的抗原表位而导致致敏性增加[9−10]，而高温高压处理可显著降低杏仁的致敏性[11]，在鸡蛋[12]、牛奶[13]和荞麦[14]的研究中也得到类似结果。本实验室前期试验结果也显示，高温高压处理可显著降低花生致敏蛋白的免疫反应性[15]，但未系统研究。因此，本研究通过免疫学方法，相对系统地研究了不同高温高压处理条件下，花生致敏蛋白主要组分Ara h1溶解性和免疫反应性的变化规律，同时考察了其在粗蛋白提取物的混合体系中上述特性的变化状况，可更加真实的反应致敏蛋白在实际加工过程中的变化，以期为花生脱敏工艺或脱敏产品的开发提供一定的基础研究支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生（鲁花1号，使用前剔除有病虫害和不完整的个体） 无锡市区超市；BSA蛋白质定量检测试剂盒、TMB/DAB显色液 上海生物工程有限公司；醋酸纤维膜（1.2 μm，德国Sartorius）、96孔酶标板（96孔聚苯乙烯，Costar）、HRP标记羊抗鼠IgG（美国Southern Biotech） 上海瑞顶化学技术有限公司；4只健康雄性新西兰大白兔（JN No. 20141111-1215（46）） 苏州高新区镇湖实验动物科技有限公司；弗氏佐剂（完全和不完全） Sigma公司；BSA蛋白质定量检测试剂盒、TMB/DAB显色液 上海生物工程有限公司；三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、丙烯酰胺、过硫酸铵、冰醋酸等 国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

5804R冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司；Mini-PROTEAN 165-8003电泳仪 美国BIO-RAD；CHEMI SYSTEM凝胶成像及分析系统 美国UVP公司；AKTA Purifier蛋白纯化系统、Hiprep 16/10 DEAE Fast Flow阴离子交换柱 美国GE公司；M5酶标仪 美国Molecular Devices公司；Milipore超滤离心管 苏州麦石生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生粗蛋白及Ara h1的制备 挑选新鲜无虫害的花生米，去除红衣后，粉碎过40目筛，得花生粉末（测水分含量）。将花生粉末与丙酮按1:10（g/mL）混合后，磁力搅拌脱脂2 h，静置待其沉淀后，弃去上清。重复脱脂一到两次。脱脂后的花生粉末在通风橱中放置过夜，使丙酮充分挥发。再将脱脂花生粉末与预先冷却的浸提液（含0.01 mol/Lβ-巯基乙醇和0.05% EDTA·2Na的0.01 mol/L PBS）按 照1:10（g/mL）混合，4 ℃下磁力搅拌过夜。浸提液在4 ℃，11000 r/min离心30 min，收集上清得花生蛋白粗提物（PP），测蛋白含量后分装保存于−80 ℃备用。

上述得到的粗蛋白液分别经40%和65%硫酸铵分级沉淀后，收集的沉淀用适量的PBS溶解[16]。溶解液用50 K的超滤离心管，在4 ℃，11000 r/min，10 min条件下复溶并离心2次，得到蛋白浓度为5 mg/mL的溶液。该蛋白溶液再经DEAE柱分离纯化，经电泳鉴定获得目标分子量（65 kDa）蛋白液。蛋白液再经50 kDa的超滤离心管浓缩并除去氯化钠，用PBS调节蛋白浓度为10 mg/mL，分装保存于−80 ℃备用。将纯化后的Ara h1进行SDS-PAGE电泳，然后将目的条带切下来，放入装有无菌水的已灭菌的AP管内，密封后，送至暨南大学生命与健康工程研究院功能蛋白质中心进行进一步质谱鉴定，确认其为花生致敏原Ara h1。

1.2.2 兔源多克隆抗体的制备 清洁级雄性新西兰大白兔4只，3个月龄左右，体重约2 kg。适应性饲养结束后，若试验动物无异常状况，耳缘静脉取约2.0 mL血液，分离得到血清后分装并于−80 ℃保存备用，即为阴性血清。1周后，对试验用兔进行首次免疫（弗氏完全佐剂与700 μg/mL抗原蛋白液等体积混合后充分乳化，颈背部皮下多点注射，剂量为1 mL/只）。第5周，进行加强免疫（弗氏不完全佐剂与700 μg/mL抗原蛋白液等体积混合后充分乳化，颈背部皮下多点注射，剂量为1 mL/只）。之后，每隔2周兔腹股沟皮下加强免疫1次，直至产生高效价的抗体[17−18]。本实验共加强免疫3次，获得Ara h1和花生粗蛋白相对应的效价分别为1:300000和1:160000的抗体血清。

1.2.3 花生蛋白的高温高压处理 Ara h1和花生蛋白粗提物（PP）的高温高压处理：将浓度10 mg/mL的蛋白液每5~8 mL分装在玻璃试管中，将试管塞轻轻盖上，小心插入定性滤纸条以免密封。然后在不同的条件下进行高温高压处理：分别在121 ℃（0.1 MPa）、135 ℃（0.22 MPa）下处理10、20、30和60 min。处理后，待样品充分冷却后，转移至离心管，在10000 r/min离心10 min，上清分装后−80 ℃保存待用，沉淀冷冻干燥后置于干燥器中保存待用。

1.2.4 可溶性蛋白含量测定 取样品上清液并将上清液梯度稀释后按说明书（BSA蛋白质定量检测试剂盒，考马斯亮蓝染色法）进行蛋白质含量的测定。

1.2.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE） 采用不连续体系SDS-PAGE垂直平板凝胶电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12.5%，浓缩胶内的电压为80 V，分离胶内的电压为120 V。电泳后，考马斯亮蓝R-250染色、甲醇-冰醋酸脱色、凝胶成像得到电泳结果[19−20]。样品上清液与上样缓冲液1:4混合煮沸3~5 min，上样量为10 μL。低分子量标准蛋白分子量为14.4~97.4 kDa。

1.2.6 免疫印迹（Western blotting） a.电泳：SDSPAGE电泳后，凝胶不染色，放入转移缓冲液中平衡至少5 min。b.转膜（半干法）：NC膜、滤纸和无纺纤维垫在转移缓冲液中浸泡20 min，从阴极到阳极，依次放置无纺纤维垫、三层滤纸、凝胶、NC膜、三层滤纸、无纺纤维垫，制作“三明治”电转芯，期间用玻璃棒赶走气泡，将其放入转印槽，200 mA转膜70 min。c.封闭：转膜结束后，37 ℃下TBS漂洗3次，每次5 min。漂洗后，加入封闭液，4 ℃过夜。d.加一抗：TBST漂洗3次，每次5 min。加入一抗（1:100，抗体血清——兔抗PE或Ara h1），在37 ℃孵育3 h。e.加二抗：TBST漂洗3次，每次5 min，加入二抗（1:2500，HRP标记羊抗兔IgG）37 ℃孵育2 h；f.显色以及终止：TBST漂洗5次，每次5 min，再用TBS漂洗3次，每次5 min。加入DAB显色液，37 ℃染色5 min后，立即拿出NC膜，用蒸馏水漂洗，以终止显色。采集照片后，避光晾干保存[19−20]。

1.2.7 间接竟争ELISA 1 μg/mL的PE或2.5 μg/mL的Ara h1在4 ℃下包被过夜，洗涤后加入一抗（1:2500兔抗PE，1:30000兔抗Ara h1）与待测样品液（稀释5倍）的混合物（1:1），37 ℃孵育1 h。再次洗涤3次，加入二抗（1:5000，HRP标记羊抗兔IgG）37 ℃孵育1 h。再洗涤4次后，加入TMB显色液，37 ℃孵育0.5 h。之后加入1 mol/L的硫酸溶液终止反应，37 ℃孵育15 min后立即在450 nm下测定吸光度值[19−20]。抑制率（%）=（1−A样/A0）×100，式中：A样是样品的吸光度值；A0是只有一抗的吸光度值。

1.3 数据处理

采用Excel 2003进行均值和标准差计算，结果以“均数±标准差”表示，并采用SPSS13.0进行统Doucan’s多重检验（P<0.05）。

2 结果与讨论

2.1 高温高压处理后样品中可溶性蛋白含量的变化

Ara h1和PP在高温高压处理后，样品溶液中蛋白的含量的变化呈现不同的变化趋势。在121和135 ℃处理条件下Ara h1随处理时间的延长，蛋白含量均呈下降趋势；135 ℃、20 min时样品中可溶性蛋白含量为对照的64%，20 min后不再随处理时间的延长而下降，且20、30和60 min处理间无显著差异（图1A）。而PP在前10 min呈现下降趋势，且明显低于对照，后由随处理时间的延长而呈上升的趋势，且135 ℃、60 min处理的样品与对照无显著差异（图1B）。由以上结果可知，高温高压处理对Ara h1溶解性的影响有限，无论是121或是135℃处理20 min后，样品中蛋白含量不再变化，其中存在热稳定性极好蛋白片段。而花生蛋白粗提物则不同，在高温高压短时间处理后，蛋白变性发生聚集，溶液中蛋白含量急剧下降；后来随时间延长，又快速上升，这提示大部分蛋白在高温高压的作用下又再次变得可溶，这也许是在极端条件下蛋白发生了降解。一般情况下，蛋白质在70~80 ℃下会造成二级结构的丧失和重构，80~90 ℃下二硫键断裂重组，90~100 ℃下形成聚集体[21−22]。Zhang等在研究传统热处理和高温高温处理对鸡蛋中主要的致敏蛋白卵铁传递蛋白（OVT）和卵类粘蛋白（OVM）的影响时，发现湿热灭菌条件（121 ℃，10 min）下可显著摧毁OVM的一级结构[12]。

图1 高温高压处理后Ara h1（A）和花生蛋白粗提物（B）样液中可溶性蛋白质含量的变化Fig.1 Soluble protein levels of Ara h1 (A) and peanut protein extracts (B) after autoclaved treatment

PP中前期的急剧下降是由于其中蛋白的热稳定性差，也可能是PP中不同的蛋白间相互作用，使其更容易发生聚集。但PP中这种可溶性蛋白质含量的变化，即10 min时的快速下降及之后的上升几乎与Ara h1不相关，因为从图1A结果中可以看出，Ara h1表现出较好的热稳定性。这与Keshavarza等[23]的在鱼致敏蛋白中的研究结果基本一致。

2.2 高温高压处理后样品中可溶性蛋白电泳图谱的变化

Ara h1经高温高压处理后其SDS-PAGE图谱发生了显著变化，65 kDa的完整Ara h1蛋白分子发生了分解，随着处理时间的延长，较小分子量的蛋白所占的比例逐步升高。这种趋势在135 ℃处理的样品中表现的更加突出，60 min时分子量为15 kDa左右的蛋白或更小的蛋白占了较大比例（图2A）。在花生蛋白粗提物体系中，高温高压处理后，完整的65 kDa的Ara h1更易从图谱中消失，这提示Ara h1在混合体系中更易发生聚集或分解，热稳定性下降。Cabanillas等的研究结果也显示，高温高压处理后，花生及经过烘焙、煎炸和水煮的花生样品的蛋白均发生了明显分解[17]。由此可知，高温高压处理可使花生蛋白及其主要致敏原Ara h1发生分解，湿热灭菌条件（121 ℃，10~20 min）时65 kDa就已明显减少，135 ℃处理20 min或更长时间后样品中15 kDa左右或更小分子量的蛋白成为分解物的主要组成部分（图2B）。

图2 高温高压处理后Ara h1（A）和花生蛋白粗提物（B）样液的SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE analysis of Ara h1 (A) and peanut protein extracts (B) after autoclaved treatment

2.3 高温高压处理后样品中可溶性蛋白免疫反应性的变化

由图3A可知，高温高压处理可使花生蛋白粗提物混合体系中或纯品Ara h1的免疫反应性均明显下降，且135 ℃处理更为明显。135 ℃处理20和60 min后，纯品Ara h1的免疫反应性分别仅为对照的1/3和1/6。同时，混合体系的环境中，Ara h1的免疫反应性在高温高压处理后下降趋势更为急剧，同样135 ℃处理20和60 min后，Ara h1的免疫反应性分别仅为对照的2/9和1/9。但是，需要明确的是，处理后Ara h1的免疫反应性的明显下降与样品中蛋白含量的下降呈一致趋势，且在PP体系中下降速度更快。这说明混合体系对于致敏蛋白的溶解性有显著影响，进而改变其免疫反应性。当然，高温高压处理使得致敏蛋白的免疫反应性的下降不能全部归因于蛋白质的不溶解性。图1A实验结果显示，Ara h1处理组在121或135 ℃下处理20 min及更长时间后样品中可溶性蛋白含量均为对照的64%，而相同处理条件下（图3A）Ara h1的免疫反应性分别仅为对照的23%、15%和11%。首先，变化趋势存在差异，可溶解性蛋白含量在20 min时达到平衡，不再明显下降；而免疫反应性呈现递减趋势。其次，免疫反应性的下降更为迅速。根据以上结果可以推断，高温高压处理使得花生致敏蛋白Ara h1免疫反应性的明显下降由两个因素导致：a. 致敏蛋白可溶解性下降，使得检测样品中蛋白含量减少；b. 样品中剩余的可溶性蛋白其免疫反应性较对照也明显减弱，可能是由于亲和力较强的蛋白片段变性沉淀，也可能是由于可溶解性片段的构象和结构发生改变导致其亲和力下降。目前有多项研究也表明，高温高压也可显著降低榛子[24]、绿豆[25]、鸡蛋[12]及荞麦[14]等致敏食物的致敏蛋白的免疫反应性，但这种降低同样与致敏蛋白的变性沉淀导致其可溶性下降密切相关。Qin等[8]的进一步研究结果显示，高温高压可降低花生致敏蛋白rAra h 2.02的3个核心的抗原表位的IgE的结合能力，并证实这与rAra h 2.02二级结构的改变导致抗原表位的掩藏相关。

图3 高温高压处理后Ara h1和花生蛋白粗提物（PP）样液的ELISA（A）和western blotting（B-Ara h1, C-PP）图Fig.3 ELISA (A) and western blotting (B-Ara h1,C-PP) of Ara h1 and peanut protein extracts after autoclaved treatment

此外，从图3B可以看到，121℃处理后，除完整的Ara h1，其分解产生的免疫活性片段主要是分子量为55、35、25和15 kDa左右的蛋白。在混合体系中，121 ℃处理后，Ara h1分解产生的免疫活性片段的分子量主要分布在为35、25和15 kDa左右（图3C）。这说明，在PP体系中Ara h1免疫反应性的快速下降与图3B中分子量在55 kDa左右的蛋白密切相关。这种较大分子量蛋白片段在混合体系中的消失可是由于其体系中其它蛋白的热变性、聚集发生沉淀时挟裹该较大分子量蛋白沉淀后造成的。Keshavarza等[23]的研究结果也显示，混合蛋白体系中，蛋白的质的热稳定性的下降更为明显，主要是由于蛋白间物理（如疏水作用）和化学（如二硫键）作用的结果。

3 结论

高温高压处理可使Ara h1及花生蛋白粗提物均发生明显的变性和分解，湿热灭菌条件（121 ℃，10~20 min）下已比较明显，而135 ℃时则非常明显。135 ℃处理20 min或更长时间后样品中15 kDa左右或更小分子量的蛋白片段成为分解物的主要组成部分。ELISA结果显示，高温高压处理可使Ara h1的免疫反应性显著下降，且在蛋白粗提物的混合体系中更为显著，这与蛋白质间相互作用相关；同时，尽管Ara h1在135 ℃处理20 min后表现出良好的热稳定性，可溶性蛋白含量不再发生明显变化，但其免疫反应性却呈现递减趋势，这表明可溶解性片段的构象和结构发生改变而导致其免疫亲和力下降，从而降低了其免疫反应性。