高碘状态下胎盘细胞中绒毛膜促性腺激素对钠碘同向转运体和pendrin的调节作用

马鑫雨，夏秋，曾秀丽，郭雯婕，李欣卓，史新竹

（1.沈阳医学院公共卫生学院预防医学专业学生，辽宁 沈阳110034；2.公共卫生学院预防医学教研室）

碘在妊娠过程中对胎儿发育起到至关重要的 作用，碘过量和碘缺乏都会对胎儿造成不良影响。在妊娠期间胎儿通过胎盘从母体摄取碘，以合成甲状腺激素，其中钠碘转运体（sodium iodide sym⁃porter，NIS）和pendrin转运体对该过程起着重要作用［1］。NIS是一种可在甲状腺、乳腺、胎盘等多个组织中表达的以钠钾离子浓度梯度为动力的主动转运体，可在促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）的作用下介导碘的转运。pendrin是一种表达于胎盘的碘离子和氯离子的被动转运体，在孕期可摄取母体碘以供胚胎生长发育［2］。胎盘分泌的绒毛膜促性腺激素（chorionic gonado⁃tropin，HCG）是维持妊娠状态的主要胎盘激素，具有调节胎盘的物质转运等功能。有文献报道，HCG受体与甲状腺中NIS主要调节激素TSH受体具有高度的结构同源性，均可调节碘的转运作用［3］。因此，本研究探讨在高碘状态下人早孕胎盘绒毛滋养细胞株（HPT－8）细胞中HCG对NIS和pendrin表达的影响。

1 资料与方法

1.1 细胞、仪器及试剂 HPT－8（第四军医大学）。CO2培养箱（美国Thermo公司），倒置显微镜（日本Olympus公司），低温高速离心机（美国Beckman公司），酶标仪（上海天呈科技有限公司），DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone），HCG（美国Sigma公司），碘酸钾（天津市光复试剂有限公司），逆转录试剂盒、Real－Time PCR试剂盒（大连宝生物工程有限公司）。

1.2 细胞培养及处理 用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HPT－8细胞，置于37℃，5%CO2的恒温细胞培养箱中待细胞铺满T25瓶底80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，传入6孔板中继续放入培养箱中生长，用于后续实验。

1.3 分组、加入试剂 用DMEM培养基配制碘酸钾母液，然后用含有10%胎牛血清的DMEM培养基将母液稀释成5 000 μg／L和500 μg／L两个剂量的高碘培养液。实验设置500 μg／L、5 000 μg／L 2个高碘组和对照组；500 μg／L高碘＋0.5 U／ml HCG组、500 μg／L高碘＋5 U／ml HCG组、5 000 μg／L高碘＋0.5 U／ml HCG组、5 000 μg／L高碘＋5 U／ml HCG组。高碘组仅加入相应剂量的高碘培养液培养48 h；高碘＋HCG组，加入相应剂量的高碘培养液24 h后再加入相应剂量HCG培养24 h；对照组仅加入相应体积的含有10%胎牛血清的DMEM培养基。

1.4 实时荧光定量PCR技术检测NIS mRNA和pendrin mRNA的表达量

1.4.1 总RNA的提取 使用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入Trizol混匀铺平，静置5 min消化，吹打至无细胞团后将其移入1.5 ml EP管，颠倒混匀，37℃静置。每管加入0.15 ml三氯甲烷，剧烈振摇，37℃静置5 min，12 000 r／min 4℃离心15 min。将上清液移至新EP管，加入等体积的异丙醇，颠倒冰上静置5 min，12 000 r／min 4℃离心10 min，留沉淀。加1 ml预冷的75%乙醇，轻轻颠倒数次，7 500 r／min 4℃离心5 min。留取管底的白色沉淀，在室温中干燥约10 min。用RNA浓度测定仪来测定总RNA的含量。

1.4.2 逆转录合成cDNA 按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，37℃15 min，85℃5 s，冰浴5 min。

1.4.3 实时荧光定量PCR扩增 实验所需引物由上海生物工程技术服务有限公司设计并合成，以稀释好的cDNA为模版进行定量PCR扩增。引物序列及扩增片段见表1。

表1 PCT扩增引物序列

反应条件为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，63℃（NIS）、61℃（pendrin）退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环；72℃延伸10 min。每个样本做平行样，重复2次。以GAPDH为内参，采用相对定量2－ΔΔCt法，分别计算目的基因的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，多组间计量资料比较采用单因素方差分析和LSD－t检验，交互作用采用析因设计分析，检验水准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同高碘水平对NIS mRNA和pendrin mRNA表达的影响 5 000 μg／L高碘组和500 μg／L高碘组的NIS mRNA和pendrin mRNA表达量均高于对照组（P＜0.01），5 000 μg／L高碘组的NIS mRNA和pendrin mRNA表达量略高于500 μg／L高碘组，但差异均无统计学意义，见表2。

表2 不同高碘水平下NIS mRNA和pendrin mRNA的表达量（±s）

表2 不同高碘水平下NIS mRNA和pendrin mRNA的表达量（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

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2.2 高碘状态下HCG对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的影响 5 000 μg／L高碘＋0.5 U／ml与5 000 μg／L高碘＋5 U／ml HCG组NIS mRNA和pendrin mRNA表达量均低于5 000 μg／L高碘组（P＜0.05），5 000 μg／L高碘＋0.5 U／ml HCG与5 000 μg／L高碘＋5 U／ml HCG组的NIS mRNA和pendrin mRNA表达量差异无统计学意义，见表3；500 μg／L高碘状态下3组NIS mRNA和pendrin mRNA表达量差异无统计学意义，见表4。

表3 5 000 μg／L高碘状态下HCG对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的影响（±s）

表3 5 000 μg／L高碘状态下HCG对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的影响（±s）

注：与5 000 μg／L高碘组比较，1）P＜0.05

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表4 500 μg／L高碘状态下HCG对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的影响（±s）

表4 500 μg／L高碘状态下HCG对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的影响（±s）

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2.3 高碘与HCG对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的交互作用 高碘和HCG对NIS mRNA的表达量不产生交互作用（R2＝0.836，F＝0.087，P＝0.776），不同浓度高碘作用下NIS mRNA表达量存在差异（F＝6.203，P＝0.037）；高碘和HCG对pendrin mRNA的表达量不产生交互作用（R2＝0.325，F＝2.970，P＝0.123），见表5和表6。

表5 高碘与HCG对NIS mRNA表达量的交互作用

表6 高碘与HCG对pendrin mRNA表达量的交互作用

3 讨论

目前，关于妊娠期摄碘量的研究多集中在碘缺乏对胎儿智力的影响，碘摄入过量是否影响胎儿脑发育研究较少。孕妇碘过量会使孕妇甲状腺功能异常，包括甲状腺机能减退症、亚临床甲减、甲状腺机能亢进症、单纯性低甲状腺素血症等［4］。有研究表明孕妇在摄入过量碘时，甲状腺疾病患病率较高，其中以亚临床甲状腺功能减退为主［5］，说明多种甲状腺疾病可能是由高碘引起的。

HCG是一种能够保证整个妊娠期处于相对稳定状态，由胎盘产生的促性腺激素，具有调节胎盘的物质转运等功能［6－8］。HCG由α和β两个亚单位组成，它们的α亚单位氨基酸序列相同，而β亚单位羟基端有独特的C终点肽结构，HCG在孕期维持妊娠激素黄体酮，保证胎儿正常发育的作用主要决定于β单位，这一功能由HCG受体调节。NIS是位于胎盘滋养层细胞膜顶端以Na＋－K＋－ATP酶产生的离子梯度为动力的主动转运体，表达于各种聚碘细胞，包括乳腺、甲状腺等［9］。pendrin是I－和Cl－被动转运的转运体，位于绒毛合体滋养层细胞刷状缘膜，具有高度疏水性的细胞膜糖蛋白，在胎盘、乳腺、子宫内膜、前列腺、睾丸和肺中均有表达［6］。在整个妊娠期间，NIS在胎盘中表达水平稳定，pendrin则在妊娠中后期表达增加，这两种物质均与母体和胎儿间的碘转运有关，调节着母体与胎儿之间的碘转运功能。本研究探讨HPT－8细胞在高碘状态下不同浓度的HCG对NIS mRNA与pendrin mRNA表达的影响，研究显示提高碘水平时NIS mRNA与pendrin mRNA表达量均明显增加，但在HCG参与下，提升高碘水平NIS mRNA的表达量反而明显降低，pendrin mRNA的表达量也有所降低，说明高碘状态下HCG可降低HPT－8细胞的摄碘能力，而且碘浓度越高HCG对NIS mRNA的下调作用越明显，pendrin mRNA变化不大。推测在碘过量的情况下，胎盘可通过HCG调节碘运输，减少对碘富集作用和向胎儿的碘运输量，保护胎儿免受碘过量造成的危害。Arturi等［10］的研究中显示在绒癌细胞系JAR中，HCG具有上调NIS mRNA表达的作用，在甲状腺中HCG具有上调细胞摄碘能力。本研究结果HCG的下调作用与Arturi等［10］的结果不一致，可能与细胞系的不同和细胞所处环境有关，本研究是在高碘环境下观察细胞的摄碘能力的变化。胎盘激素作用非常复杂，可以对机体多个靶器官和靶细胞产生多种作用；不仅可以进入血液循环后通过内分泌的途径发挥作用，而且还可以通过组织间液作用于相邻的细胞或自身细胞，在胎盘或者其他子宫内组织形成复杂的旁分泌和自分泌局域网，互相影响、相互作用。本研究还观察到HCG与高水平碘对NIS mRNA和pendrin mRNA表达量不存在交互作用，其原因可能是胎盘细胞处于高碘环境时，提高碘水平NIS mRNA和pendrin mRNA表达量的升高不明显，反而HCG的降低作用显著，因此进一步说明高碘环境下HCG具有降低胎盘细胞的摄碘能力的作用。

综上所述，在胎盘细胞中当碘过量时HCG降低NIS mRNA的表达，pendrin mRNA的表达量有所下降，说明高碘状态下HCG可降低胎盘细胞的摄碘能力，从而减少了胎盘对碘的摄取，保护胎儿免受碘过量带来的危害。