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细胞贴壁效应是评价胎牛血清质量的重要因素

2021-11-30刘雪莉郭庆王静王霄肖捷王斌余巍

农业与技术 2021年22期
关键词:胎牛培养皿明胶

刘雪莉 郭庆 王静 王霄 肖捷 王斌 余巍

(1.大理大学药学院,云南 大理 671003;2.解放军联勤保障部队第920医院,云南 昆明 650031;3.昆明学院农学与生命科学学院,云南 昆明 650214)

动物细胞培养技术的发展极大地推进了现代生物医药产业的发展,该技术被广泛应用于单克隆抗体的制备、重组蛋白药物的研发、人造器官移植等行业,成为生物制药领域的关键技术之一[1]。由于血清具有终止胰蛋白酶消化,提供细胞生长所需的贴壁因子、免疫球蛋白、胰岛素等其它营养成分及细胞因子,因此成为体外细胞培养液中的常用添加成分,其对细胞的培养意义重大[2,3],其为细胞生长和维持提供了必要的活性成分[4]。胎牛血清(FBS)从母体内胎儿中获取,含有多种生长因子和细胞因子,可模拟细胞增殖和维持[5],含有大量的蛋白成分,最主要的蛋白成分有白蛋白、A1抗胰蛋白酶、转铁蛋白、Ig类抗体,还有含量不等的如A2巨球蛋白、A1和B1脂蛋白、胆固醇、纤维结合蛋白、胆红素和类胡萝卜素等成分[6],是许多重组蛋白及药物生产和研发用细胞培养基中的关键成分,对细胞生长的需要仍难以大规模的用其它物质所代替。另外,胎牛血清中胎球蛋白A(fetuin-A)等成分的差异在培养细胞粘附中已发挥重要作用[7]。研究表明,细胞通过其粘附蛋白包括纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn)和体外连接蛋白(Vitronectin,Vn)吸附在人工材料的培养皿上。不同比例的白蛋白和胎牛血清混合溶液等复杂介质对Fn和Vn通过培养皿表面自组装单分子膜对细胞粘附的作用有较大差异[8]。在日常的细胞培养过程中,发现使用不同来源生产厂家的胎牛血清配制培养液,对细胞的生长速率及状态的影响存在明显差异,尤其在更换培养装置后,差异更为明显。分析可能是不同胎牛血清的细胞粘附相关因子之间的差异所致,因此推测胎牛血清的细胞粘附效应可能是影响贴壁细胞生长、分化、繁殖及凋亡等生命活动的关键因素。

明胶是一种公认安全的水胶体,应用范围广泛,是胶原的部分水解产物,存在细胞结合位点,酶解产物无毒且易被吸收,具有生物相容性高和亲细胞性强等优点,可增加细胞粘附力,促进细胞贴壁、增殖,可改变细胞生长微环境,为细胞生长环境提供力学支持[9-11]。本研究主要以0.1%明胶包被培养装置,用重组药物生产细胞——中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞为培养物,将CHO细胞培养于不同的培养装置并连续培养3代,通过对比1种常用的进口胎牛血清与2种国产胎牛血清在不同培养装置培养细胞时,使用0.1%明胶包被培养装置前后为对比,分析在改变贴壁效应后,3种胎牛血清在细胞生长密度、活力等指标的变化差异,以验证血清的贴壁效应决定细胞生长状态的推测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

CHO-K1细胞株(ATCC 编号为CCL-61)。

1.1.2 胎牛血清

国产1号购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司,TBD优级胎牛血清,货号:TBD25HY;国产2号购自上海源叶生物科技有限公司,货号:MP20001胎牛血清;进口购自以色列BI Biological Industries,货号:04-102-1ACS。

1.1.3 主要试剂

RPMI 1640,购自以色列BI Biological Industries,货号:11-100-1N;碳酸氢钠(NaHCO3)购自中国美仑生物,货号:MB0115;青霉素-链霉素-两性霉素B(100×)购自中国新赛美生物科技有限公司,货号:C125C8;胰蛋白酶-EDTA消化液购自中国Solarbio公司,货号:T1300;1%明胶购自中国Solarbio公司,货号:G0040;培养皿购自美国CORNING公司;T25培养瓶购自中国Crystalgen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养液的配制

具体见表1。

表1 1L细胞培养液的配制

1.2.2 细胞培养

试验时培养细胞分为2组。将CHO细胞以相同的起始量接种于T25瓶和培养皿内,T25瓶和培养皿内的培养液总体积固定为10mL,每种血清、每种培养装置分别设3个重复,在37℃、5%CO2的培养箱中密闭培养。以使用进口胎牛血清的细胞为对照,将使用国产胎牛血清的培养装置,用0.1%的明胶包被,将细胞以相同的起始量接种于T25瓶和培养皿内,T25瓶和培养皿内的培养液总体积固定为10mL,每种血清、每种培养装置分别设3个重复,在37℃、5%CO2的培养箱中密闭培养。待细胞汇合度达到90%以上时,使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞,分别进行计数,计算每组细胞密度、细胞均数、细胞活力。

1.2.3 明胶使用方法

使用无菌去离子水将1%的明胶稀释成0.1%,取适量体积0.1%的明胶,加入待用的培养装置中,均匀分布在培养装置的底部,在5%CO2、37℃培养箱中放置1h后取出,吸弃多余明胶,无菌干净操作台吹干备用。

1.2.4 细胞计数及细胞活力计算

细胞汇合度达到80%~90%后,使用台盼蓝染色法,在生物显微镜下计数。细胞活力的计算公式:

细胞活力=(细胞总数-死细胞总数)/活细胞总数×100%

1.2.5 统计学分析

使用Origin Pro 8.5软件对数据进行单因素方差统计分析,若P<0.05,说明数据之间有显著性差异。

2 结果

2.1 胎牛血清在不同培养装置对细胞密度及活力的影响

通过倒置光学显微镜观察细胞,使用进口胎牛血清配制的培养基的细胞汇合度已经达到90%以上,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞,使用台盼蓝染色法,在生物显微镜下进行计数,分别计每组细胞的死细胞与活细胞数量,根据计数结果,计算每毫升培养液中细胞的密度,见图1a、图1b。结果显示,在T25瓶内进口胎牛血清对细胞密度的影响与国产1号胎牛血清之间呈极显著差异,与国产2号胎牛血清之间无显著差异;国产2号与国产1号胎牛血清之间也有显著差异。在培养皿内,进口胎牛血清对细胞密度的影响与国产1号胎牛血清之间有显著差异,与国产2号胎牛血清之间无显著差异,而国产1号与国产2号胎牛血清无显著差异。即无论在T25瓶内还是在培养皿内培养CHO细胞,国产2号胎牛血清与进口胎牛血清对细胞密度的影响均无显著差异,但是国产1号与国产2号之间的差异在不同培养装置中则表现不同。

根据不同培养装置比较每组细胞的细胞活力,如图1c、图1d所示,T25瓶内3组数据中P>0.05,说明3组数据无显著性差异;但在培养皿内3组数据中P<0.05,说明3组数据有显著性差异,即进口胎牛血清与国产1号、国产2号胎牛血清对细胞活力的影响之间均呈显著差异;但国产1号与国产2号之间无显著差异。结果表明,使用培养皿与T25培养瓶培养细胞时,3种胎牛血清对细胞生长活力存在显著性差异。

图1 未使用明胶时不同胎牛血清于不同培养装置对CHO细胞密度及细胞活力的比较注:**表示在P<0.01水平上的显著关系;*表示在P<0.05水平上的显著关系。

2.2 胎牛血清在明胶包被的培养装置中对细胞密度及活力的影响

考虑到胎牛血清中粘附因子与不同培养装置之间可能存在粘附效应的区别。用0.1%的明胶对不同的培养装置进行包被,研究3种胎牛血清配制的培养液对细胞生长是否有差异。

细胞培养24h后,在倒置光学显微镜下观察细胞,如图2,显示未使用明胶时,进口胎牛血清配制的培养液的细胞密度大于使用国产胎牛血清的细胞密度,国产2号的细胞密度大于国产1号。当使用明胶后,使用国产2号胎牛血清的细胞密度优于国产1号与进口胎牛血清,国产1号与进口胎牛血清无明显差别。

图2 使用明胶前后不同的胎牛血清之间细胞密度的比较(×10)

通过比较细胞密度和活力,结果如图3所示,在T25瓶内,使用国产2号的细胞密度高于使用进口胎牛血清的细胞,并与其有极显著性差异(P<0.01);在培养皿内,使用进口胎牛血清的细胞产量略高于使用国产胎牛血清的细胞,但P>0.05,三者无显著性差异。细胞活力方面,无论在T25瓶内还是在培养皿内,使用2种国产胎牛血清和进口胎牛血清配制的培养液对细胞活力影响均无显著性差异。

图3 使用明胶后不同胎牛血清于不同培养装置对CHO细胞密度及细胞活力的比较注:**表示在P<0.01水平上的显著关系;*表示在P<0.05水平上的显著关系。

研究表明,当培养装置使用0.1%明胶包被后,2种国产胎牛血清对细胞生长密度和活力的影响发生显著变化。另外,用明胶提高培养装置的粘附效应后,培养装置之间的差异也消失了,表明不同胎牛血清中的粘附分子与培养装置产生的粘附效应对细胞生长和活力的影响非常重要。

3 讨论

胎牛血清由于生长因子含量丰富,已成为细胞培养基的标准补充剂[12],其优势包括细胞增殖和维持所需的大多数因子的混合物;几乎是通用的生长补充剂,对大多数类型的人和动物细胞都有效(包括昆虫);使用补充血清的培养基减少了为每种细胞类型开发特定的、优化的培养基配方所需的时间和精力[13]。对胎牛血清质量的评价是发展国产高端胎牛血清的重要基础。

根据本次实验对比,以细胞密度变化为评估指标时,在T25瓶内国产1号与进口胎牛血清和国产2号胎牛血清对细胞密度的影响呈显著差异,而在培养皿内国产1号与国产2号之间差异则不显著。当以细胞活力为评价指标时,进口胎牛血清与2种国产胎牛血清于T25瓶内对细胞活力的影响均无显著性差异(P>0.05),但在培养皿内则呈有显著性差异(P<0.05)。表明血清中粘附因子与培养装置表面的粘附效应是影响细胞生长和活力的关键因素。使用0.1%明胶包被培养装置后,改变培养皿表面的粘附效应后,国产1号胎牛血清无论在T25瓶内还是培养皿内,与进口胎牛血清对细胞的密度及细胞活力之间都无显著性差异(P>0.05);而国产2号胎牛血清在T25瓶内,对细胞密度的影响甚至优于进口胎牛血清(P<0.01)。进一步证明了胎牛血清中粘附分子产生的粘附效应对细胞生长和活力的关键影响。综合来看,2种国产胎牛血清都可能因为粘附分子的优化组合导致细胞对不同培养装置的粘附效应略逊于进口胎牛血清,进而导致了其对细胞生长速度和活力影响的下降。该结果表明胎牛血清的粘附效应对细胞生长非常重要,可作为评价胎牛血清质量的重要指标。

另外,细胞的培养除了对细胞条件培养基有较高要求外,生命科学的快速发展对高分子材料的培养装置表面性能如浸润性、黏附性、生物相容性、电学性能、阻燃性等提出了更高的要求[14]。不同厂商生产的T25瓶和培养皿表面对细胞的粘附能力存在区别。当培养装置使用明胶包被后,可以通过增加其粘附性改变不同装置对细胞粘附效应的影响,从而从不同的角度评价3种胎牛血清对细胞生长的影响。

Kyungsook Kim等[4]研究表明,在含FBS培养基中培养的间充质干细胞(MSC),含有较高的稳定细胞粘附相关的β-肌动蛋白和整合素β-1(ITGβ1)的基因表达水平,并且随着细胞密度的增加而增加。细胞微环境以多因子(趋化因子、细胞外基质)协同的方式对细胞粘附与迁移进行调控[15]。而胎牛血清以及高分子材料的细胞培养装置,会对细胞的微环境产生一定的影响。当细胞粘附在基底上时,细胞骨架会通过整合素(Integrin)与基底进行连接,并通过粘着斑将肌动蛋白和肌球蛋白II产生的力学刺激传递给细胞外基质[16]。推测本文所选的3种胎牛血清在细胞粘附因子的成分上有所差异,可能由于不同细胞粘附因子的组成与细胞培养容器表面分子发生相互作用,导致细胞生长速度和活力的差异。

本研究发现胎牛血清中粘附因子成分与细胞培养容器表面分子相互作用对细胞活力产生的影响,同时证明胎牛血清的粘附效应是评价胎牛血清质量的重要指标。

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