HPLC法测定双乌扶筋膏中川续断皂苷Ⅵ的含量

崔思娇，张大军，巴琳，汪宇，栾天∗

（1.沈阳医学院药学院化学教研室，辽宁 沈阳110034；2.中国人民解放军北部战区空军医院药剂科）

膏药作为中医传统剂型应用至今已有千余年的历史，从《中国药典》1977年版［1］首次将膏药作为一个单独剂型收载，到《中国药典》2015年版［2］对膏药外观性状、贮藏条件和检查项目等作以具体规定，膏药的质量标准逐步提升，但依旧缺少反映黑膏药质量的客观指标和检测方法，因而现阶段质量控制仍多凭借经验判断。目前国内对黑膏药质量的研究鲜见报道［3－6］，可能是因为其处方复杂，多味中药成分相互作用，炮制过程中产生新的物质，难以选择代表性的成分作为控制指标；制剂工艺均需高温油炸，导致其成分多被破坏；黏性大、吸附性强的基质加大了分析时处理样品的难度。

双乌扶筋膏是中国人民解放军北部战区空军医院自主研发生产的黑膏药制剂，主要由生草乌、生川乌、生南星、川牛膝、续断等多味中药组成。具有软坚散结、祛瘀消肿、散寒定痛、舒筋活络功效，用于骨质增生、颈椎病、肩周炎、腰椎病、风湿、类风湿引起的筋骨疼痛等症，经临床应用多年，疗效显著，但其质量标准中尚无含量测定标准。续断是双乌扶筋膏的主药，其有效成分川续断皂苷Ⅵ（图1），经现代药理学证实，其具有保护骨组织﹑抗炎﹑镇痛等药理活性，并且能够多靶点发挥药效［7］。因此，可选择川续断皂苷Ⅵ作为双乌扶筋膏的质量控制指标。目前，有关黑膏药的制剂中，以HPLC对其中的药物进行含量测定的方法鲜有报道。为提升双乌扶筋膏的质量标准，本研究建立了双乌扶筋膏中主要成分之一川续断皂苷Ⅵ的HPLC含量测定方法。

图1 川续断皂苷Ⅵ的化学结构

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent Technologies 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪（美国Agilent公司），AUW220D电子分析天平（日本Shimadzu公司），HH·S电热恒温水浴锅（江苏红旗医疗器械厂），旋转蒸发器RE－520A（上海亚荣生化仪器厂），SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试药 双乌扶筋膏样品为中国人民解放军北部战区空军医院制剂室生产（批号20191228、20200121、20200310），规格为10 g／贴。川续断皂苷Ⅵ对 照 品（批 号111685－201707，纯 度90.9%）购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇、色谱纯为天津市四友精细化学品有限公司；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［8－10］Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈－0.1%磷酸水溶液（26∶74，V／V），检测波长为212 nm，流速1.0 ml／min，柱温30℃，进样量10 μl。

2.2 单因素试验 首先将提取时间固定为3.0 h，取双乌扶筋膏样品（批号20200121）6贴，置－20℃冰箱中冷冻1 h后取出，剥离药物，捣碎，混匀，称取本品膏体约50 g，精密称定，置锥形瓶中，加水500 ml，分别在50﹑60﹑70﹑80及90℃下进行水浴提取，放冷，过滤取滤液。蒸干滤液，残渣加30 ml甲醇溶解，过滤取滤液，浓缩，定容至5 ml量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用，按2.1项下色谱条件进行测定，其提取温度与之对应的样品含量测定结果见表1。随后，将提取温度固定为80℃，提取时间依次设定为1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h，按上述同样方法测得提取时间与对应的样品含量，结果见表2。

表1 川续断皂苷Ⅵ的含量与提取温度

表2 川续断皂苷Ⅵ的含量与提取时间

2.3 溶液的制备 （1）对照品溶液的制备：精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，加甲醇制成0.5 mg／ml的对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：取双乌扶筋膏6贴，置－20℃冰箱中冷冻1 h后取出，剥离药物，捣碎，混匀，称取本品膏体约50 g，精密称定，置锥形瓶中加水500 ml，80℃下水浴提取2.5 h，放冷，过滤取滤液。蒸干滤液，残渣加30 ml甲醇溶解，过滤取滤液，浓缩，定容至5 ml量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。（3）阴性对照品溶液的制备：按处方量并以相同工艺制备不含续断的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性试验 精密吸取2.3项下对照品、供试品、阴性对照品溶液各适量，按照2.1项下色谱条件测定。理论塔板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算不低于3 000，分离度大于1.5。色谱图见图2。

图2 双乌扶筋膏的HPLC图

2.4.2 线性关系考察 将2.3项下对照品溶液稀释成5个质量浓度的溶液，依次为20、50、100、250、500 μg／ml，按2.1项下色谱条件依次进样测定。以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得到川续断皂苷Ⅵ对照品回归方程Y＝3.935 4X－1.497 8，r2＝0.999 9。结果表明川续断皂苷Ⅵ在20~500 μg／ml范围内质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验 吸取对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续重复进样6次，测得川续断皂苷Ⅵ峰面积RSD为0.37%（n＝6），表明该方法精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取双乌扶筋膏（批号20200121）6份，依照2.3项下方法制备供试品溶液，依次进样，结果显示川续断皂苷Ⅵ的平均浓度为0.228 mg／ml，RSD为1.33%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 吸取供试品溶液（批号20200121）于0、4、8、12、16、24 h依次进样并计算含量，结果显示川续断皂苷Ⅵ含量测定的RSD为1.31%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.6 加样回收试验 取已知含量的双乌扶筋膏（批号20200121，含量20.4 μg／g）6份，精密称定，分别准确加入川续断皂苷Ⅵ对照品适量，按2.3项下方法制成供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，结果显示川续断皂苷Ⅵ的平均回收率为96.74%，RSD为1.49%（n＝6），结果表明该方法的回收率良好。见表3。

表3 双乌扶筋膏中川续断皂苷Ⅵ加样回收率试验结果（n＝6）

2.5 样品含量测定 取批号为20191228、20200121、20200310的双乌扶筋膏样品各约50 g，精密称定后，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，以外标法计算川续断皂苷Ⅵ的含量。实验结果见表4。

表4 双乌扶筋膏中川续断皂苷Ⅵ的含量测定结果

3 讨论

川续断皂苷Ⅵ为糖苷取代的五环三萜类化合物，其化学结构如图1所示，因其结构中存在大量的醇羟基，故此，其在醇类溶剂以及水中溶解度较高，并且随着温度的升高其溶解度显著增加。因此，在提取溶剂的选择中，本研究选择甲醇、乙醇、水三种提取溶剂进行比较。结果显示，甲醇与水的提取率相对较高，但以水为提取溶剂制备的供试品溶液所得图谱中杂质峰较少，与其他杂质峰分离度较好，且基线平稳，因此本研究选用水作为提取溶剂。

在提取方式的考察中，以水为溶剂首先考察了回流提取法，发现大量基质溶于提取液中，以致提取液浓缩后过于黏稠，无法通过微孔滤膜处理检测。其次考察了超声提取法，发现超声提取后供试品呈膏体状聚集，制得的供试品中川续断皂苷Ⅵ含量极低，其原因可能是因为样品中大量基质经过长时间超声软化聚集，使得药物有效成分粘附在基质中，造成有效成分的损失。最后，本研究选择在80℃下进行水浴提取法，试验结果表明，制得的供试品溶液澄清，提取率较高且所得供试品溶液图谱中杂质峰较少，因此选择水浴提取方式进行供试品溶液的制备。

在提取温度与时间的考察中，在提取温度上分别进行了50、60、70、80及90℃下的提取试验，结果显示，提取温度为80℃时川续断皂苷Ⅵ含量最高，当温度上升到90℃时，提取液黏度大大增加，较难过滤，且含量不再增加，故此将提取温度确定为80℃。随后，在提取时间上分别进行了1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h的提取试验，结果显示，在80℃水浴提取2.5 h后，所制得的供试品样品中川续断皂苷Ⅵ含量无显著变化，考虑到试验时间和能源成本，本研究最终将水浴提取温度确定为80℃，提取时间确定为2.5 h。

综上所述，本研究采用HPLC法测定双乌扶筋膏中川续断皂苷Ⅵ的含量，解决了黑膏药样品难处理的问题，采用水浴提取法防止大量基质对主成分含量测定的干扰，提高了双乌扶筋膏的质量标准，使黑膏药的质量控制客观规范化，同时为相关领域的研究提供了参考。