8省20个产地三叶青中3种黄酮苷成分含量测定与相关性分析

朱烨婷 华金渭 盛云杰 王诗语 秦路平 朱 波

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤，是我国特有的珍稀药用植物[1]。三叶青主要分布于我国浙江、福建、广西、云南等地，以地下块根入药，具有清热解毒、活血散结、消炎止痛、祛风化痰、理气健脾等功效，常用于小儿高热惊厥、痢疾、支气管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性脑膜炎、毒蛇咬伤、扁桃体炎、跌打损伤等疾病的治疗[2]。现代药理学及化学成分研究表明，其主要活性成分为黄酮类[3]、有机酸类[4]、酚类[5]及挥发油类[6]等，具有增强免疫[7]、保肝护肝[8]、抗肿瘤[9]、抗炎[10]、抗病毒[11]等作用。三叶青现有报道多集中在化学成分分离鉴定[12]、栽培技术[13]、分子标记[14]等方面，而对于以有效成分为主要参考指标评价不同种质三叶青的质量鲜有报道。三叶青野生资源稀缺，近年来各地均开展人工栽培驯化，不同产地的三叶青外观性状、药理活性、产量及价格均差异悬殊，三叶青化学成分的差异会影响三叶青药材质量以及临床用药疗效。三叶青中黄酮类和多糖类化合物的含量远高于其他化学物质，黄酮类具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎等多种生理活性[15]。本试验收集全国三叶青主产区20个种质资源，建立同时测定块根中芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷的超高效液相色谱（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）方法，并分析其与生境因子间的相关性，为三叶青质量控制和资源合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料、试剂与仪器 采集浙江、湖南、广西、江西、湖北、贵州、重庆等8省20个产地新鲜健康三叶青块根，经浙江中医药大学张巧艳教授鉴定为葡萄科三叶青Tetrastigma hemsleyanum（见表1）。标准品：异槲皮苷（B21529）、山奈酚-3-O-芸香糖苷（B21133），福林酚试剂（S30000）均购自上海源叶生物科技有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、碳酸钠等试剂购自杭州木木生物科技有限公司，色谱级甲醇、乙腈购自上海百灵威化学技术有限公司，其他试剂为分析纯。实验仪器：Waters 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；Milli-Q-Academic 超纯水仪（美国Millipore 公司）；DHG-9031A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信试验仪器有限公司）；D37520 快速离心机（德国Heraeus 公司）；MA110 型电子天平(上海第三分析仪器厂)；RE-2000 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；YQ-1002C 型超声波清洗机（上海易净超声波仪器有限公司）；FW100 高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市瑞德仪器设备有限公司）。

表1 样品信息

1.2 芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量测定

1.2.1 样品溶液制备与含量测定 称取样品粉末2g至100mL 烧瓶，加入40mL 80%甲醇室温超声提取10min，抽滤旋干，用30%甲醇定容至2mL 容量瓶，0.45μm 滤膜过滤，待用。

1.2.2 色谱条件 Waters UPLC 色谱柱，BEHC18（2.1×150mm，1.7μm）；流动相为甲醇与0.1%甲酸水，采用梯度洗脱；柱温45℃；检测波长300nm；流速0.25mL/min；进样量1μL。

1.2.3 线性关系考察 配制质量浓度为0.2mg/mL的芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷混合对照品溶液，分别采用原液、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 稀释液，在上述色谱条件下测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2。

表2 芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷线性关系考察

1.2.4 精密度试验 取同一混合标准品溶液，按照线性关系考察方法测定光密度（optical density，OD）值，连续测定6 次，测得芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值分别为0.42%、1.10%与0.66%，仪器精密度良好。

1.2.5 重复性试验 取重庆梁平样品6 份，按照样品溶液制备与含量测定方法测定OD 值，得样品平均芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量为0.0160、0.0115、0.0297mg/g，RSD值分别为1.99%、2.01%、1.66%，试验重复性良好。

1.2.6 稳定性试验 取重庆梁平样品，按照“1.2.1”方法制备样品溶液，室温避光保存，分别在1、2、4、6、8、10、12、24h 测定OD 值，计算得芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量RSD 值分别为0.82%、0.95%、1.10%与1.43%，表明样品溶液在室温避光保存24h 内稳定。

1.2.7 加样回收率试验 取重庆梁平样品6 份，加入质量分数为0.02mg/mL 的芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷混合对照品溶液1mL，按照上述样品制备方法与色谱条件下测定峰面积，计算加样回收率（%）=（C-A）/B×100%，A 为样品各成分含量，B 为加入对照品含量，C 为实际测得含量。结果显示，芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷平均回收率分别为98.39%、101.16%与98.96%，RSD 值分别为3.79%、3.54%与3.35%。见表3。

表3 加样回收率试验（n=6）

1.3 清除DPPH 自由基能力测定 精密称取样品粉末1g 至水解管，加20mL 甲醇80%超声10min，过滤定容至25mL 容量瓶，将母液稀释成25、12.5、10、6.25、5、3.125、2.5、1.25、0.625、0.5mg/mL的样品溶液，进行清除DPPH 自由基的抗氧化能力测定。配制0.1mol/L 的DPPH 溶液，利用DPPH 溶液特征紫红色团在波长517nm 下有最大吸收，并在加入抗氧化剂提取物后出现吸收下降的表现，表示其对有机自由基的清除能力。按照公式计算DPPH 清除率，清除率=[1-（A1-A0）/ACK]×100%，A1 为1mL 样品＋1mL DPPH 的OD 值，A0 为1mL 样品＋1mL 无水乙醇的OD 值，ACK 为1mL 溶剂＋1mL DPPH 的OD 值。用SPSS 17.0 软件回归拟合不同浓度醇溶性成分的清除DPPH 自由基能力函数曲线，采用Probit 模型，以清除DPPH 自由基能力为响应频率，观测值汇总为1，样品浓度为协变量进行模型分析，以置信限制中概率为0.50 时的浓度作为半抑制率（IC50 值）[16]。

图1 超高效液相色谱图

1.4 统计学方法 应用Excel 2007 对数据进行整理与相关性分析；应用SPSS 17.0 软件处理数据，采用单因素analysis of variance（ANOVA）法分析，两两比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD），P<0.05 为差异有统计学意义；应用DPS 9.05 软件进行系统聚类分析，根据欧氏距离采用类平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）[17]。

2 结果与分析

2.1 三叶青中3种黄酮苷含量及清除DPPH 自由基能力比较 不同产地三叶青块根中芦丁、异槲皮苷与山奈酚-3-O-芸香糖苷含量存在差异（P<0.01），平均含量分别为0.0058、0.0059、0.0127mg/g。其中，广西田林三叶青芦丁含量最高，达0.0302mg/g，但有11个样品未检测到芦丁含量；福建建阳三叶青异槲皮苷含量最高，为0.0135mg/g，有4个样品未检测到异槲皮苷含量；广西乐业三叶青山奈酚-3-O-芸香糖苷含量最高，为0.0463mg/g，全部样品均能检测到山奈酚-3-O-芸香糖苷，其变幅为0.0014～0.0463mg/g。不同产地三叶青块根醇提物对DPPH 自由基均有一定的清除作用，但存在差异，其中浙江景宁与福建建阳三叶青清除DPPH 自由基能力最强，IC50 值均为0.683mg/mL，湖南怀化种质清除DPPH 自由基能力最弱，IC50 值为19.624mg/mL。见表4。

表4 不同产地三叶青芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷含量与IC50 值比较（n=3）

2.2 黄酮苷含量与农艺性状、生境因子的相关性三叶青块根中3种黄酮苷含量与块根农艺性状、生境因子间存在相关性（见表5），与块根纵径、块根横径、块根重、海拔呈正相关关系，其中异槲皮苷含量与块茎横径呈最大正相关，相关系数达0.7046；与块根纵横径比、经度、纬度呈负相关关系，其中异槲皮苷含量与经度呈最大负相关，相关系数为-0.7151。相关性分析显示，低经纬度、高海拔地区种植三叶青，有利于其块根中黄酮苷含量积累。

表5 三叶青黄酮苷含量与生长性状、生境因子的相关性分析

2.3 聚类分析 以块根生长性状、黄酮苷含量为指标，对20个三叶青样品进行聚类分析，并按照D2=18.96 的聚类水平将20个三叶青样品划分为4 类（见图2）。第Ⅰ类群共8个种质，以浙江种质为主，分别为浙江莲都1、浙江莲都2、浙江庆元、湖南怀化、浙江景宁、浙江遂昌、浙江青田、浙江黄岩，该类群植株叶片小而狭长或宽钝，颜色深绿背部无柔毛，茎较细，圆柱形，根系较发达，块根小，表面多光滑，黄酮苷含量较低；第Ⅱ类群共4个种质，福建建阳、湖北咸丰、江西弋阳与浙江泰顺，该类群植株叶片较宽钝，茎较粗，方形或少圆形，块根中等大小，表面褶皱或光滑，黄酮苷含量除福建建阳样品外，其余样品含量较低；第Ⅲ类群共4个种质，以广西样品为主，分别为广西田林、乐业、天峨和重庆梁平，该类群三叶青叶片较大而狭长或宽钝，颜色多浅绿背部有柔毛，茎较粗，方形，根系发达，块根大，黄酮苷含量较高；第Ⅳ类群共4个种质，分别为贵州赤水、重庆綦江、广西钟山与湖南汝城，该类群三叶青植株形态与第Ⅲ类群类似，块根较大，黄酮苷含量较低。

图2 聚类分析图

3 小 结

目前市场上三叶青药材野生资源日益匮乏，人工栽培条件受限，栽培种质混乱，不同产地三叶青在生长性状、有效成分含量等方面存在差异，故收集并评价不同产地三叶青有效成分含量对三叶青良种选育与高产栽培具有重要意义。药用植物在长期适应环境的过程中，通过调控次生代谢产物的积累，抵抗害虫、物理、化学等生物性与非生物性环境因子胁迫，其生物学性状、生态适应性、农艺性状、药效成分等受自身遗传与环境因子双重影响，产地、经纬度、海拔、气候条件等环境因子是影响中药材生长与药效成分含量积累的重要因素[18]。本实验结果表明，20个三叶青种质的块根中芦丁、异槲皮苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷含量存在差异，其中重庆、福建、广西三叶青黄酮苷含量较高，贵州次之，浙江、湖北、湖南、江西较低；块根中黄酮苷含量与块根生长性状、生境因子间存在相关性，与块根纵径、块根横径、块根重、海拔呈正相关关系，与块根纵横径比、经度、纬度呈负相关关系，结果提示三叶青优良种质筛选可优先在低经纬度、高海拔地区种植的重庆、福建、广西种质中选择。

中药材实际栽培应综合考虑有效成分含量、药材产量、种质生态适应性差异、立地条件优劣等多方面因素。单一指标含量高低并不能明确评价药材质量优劣，因此，尽快统一三叶青药材含量评价指标，建立三叶青药材化学成分指纹图谱，并综合药效学、药代动力学等建立三叶青药材质量评价体系，是促进三叶青产业健康可持续发展的关键。综合生长性状与黄酮苷含量，初步筛选出重庆綦江、重庆梁平、广西乐业、广西田林、福建建阳5个三叶青优良种质，生长势好，块根中黄酮苷含量高，下一步可优先对初筛优良种质进行同一栽培区域内的大田育种试验。三叶青分布地域广，本实验收集了20个产地种质资源，其中如福建、贵州、江西等地种质，仅收集到1个样品，代表性弱，后续工作将加强对福建、贵州、江西等地三叶青的种质资源收集与评价，以期为三叶青种质资源利用与优良品种选育提供科学依据。