谷凝皙（Growgx）酵母发酵产物提取物在皮肤抗衰老中的功能与机制

尤一 马怡晗 段小群

摘要：目的  本研究旨在通过建立HFF-1细胞水平的皮肤衰老模型，进一步从分子水平探究谷凝皙（Growgx）酵母发酵产物提取物抗衰老的具体机制。方法  使用UVA辐射仪照射HFF-1细胞建立细胞衰老模型;通过MTT法检测不同浓度Growgx酵母发酵产物提取物对UVA辐照后HFF-1细胞存活率的影响;通过使用流式细胞术检测Growgx酵母发酵产物提取物对HFF-1细胞内活性氧（ROS）水平的表达影响，以及通过Western Blot检测Growgx酵母发酵产物提取物对抗衰老的相关蛋白的表达影响。结果  辐照剂量为10.8 J/cm2 的UVA可以导致HFF-1细胞的存活率显著被抑制（P< 0.05），而Growgx酵母发酵产物提取物可以显著抑制辐照剂量为10.8 J/cm2的UVA导致的HFF-1细胞存活率的降低。另外，Growgx酵母发酵产物提取物以剂量依赖方式清除细胞衰老模型中ROS的含量（P< 0.05），并且还能上调I型胶原（Collagen I）和下调基质金属蛋白酶1（MMP-1）的蛋白表达（P< 0.05）。结论Growgx酵母发酵产物提取物能够通过抑制细胞内ROS的过表达，以及影响皮肤衰老相关蛋白的表达来抗皮肤衰老。

关键词：皮肤衰老;谷凝皙（Growgx）酵母发酵产物提取物;活性氧;I型胶原;基质金属蛋白酶1

项目来源：广西自然科学基金面上项目（2018GXNSFAA138098）

引言

皮肤是人体最大的器官，保护我们的内部器官免受外部世界的影响。皮肤由表皮、真皮和皮下组织组成，在皮肤老化过程中，真皮层的变化最为明显。皮肤老化包括内在老化和外在老化，其中皮肤的内在老化是随年龄的增长而发生，表现为皮肤干燥、变薄、细纹、瘙痒。而外在老化则由紫外辐射引起，特征是深皱纹、皮肤松弛和色素过度沉着，导致皮肤过早衰老。人类表皮生长因子（Human epidermal growth factor， hEGF）在皮肤修复、再生及抗衰老中起着重要作用。然而hEGF分子量大且具有很强的亲水性，导致皮肤渗透和细胞吸收不够理想，显著限制了其功效。谷凝皙（Growgx）酵母发酵产物提取物是一种类hEGF功能的小分子混合物，其分子量小、皮膚渗透性较好、可以有效修复皮肤衰老，在临床上有巨大的开发前景。本实验旨在探究Growgx酵母发酵产物提取物对皮肤衰老的修复作用及机制。

1  材料与方法

1.1主要材料与试剂

Growgx酵母发酵产物提取物由桂林华诺威基因药业有限公司提供;Collagen Ⅰ抗体、MMP-1抗体和β-actin抗体购自Bio-world公司;MTT试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司;DMEM培养基购自Gibco公司;活性氧检测试剂盒购自北京拜尔迪生物技术有限公司。UVA辐照仪购自Sigma公司;Western blotting系统购自美国伯乐公司;光学读数分析天平购自北京赛多利斯天平有限公司;流式细胞仪购自Beckman Coulter公司;低温高速离心机购自eppendorf公司;酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司;UVA辐照仪SS-01购自上海希格玛高技术有限公司。

1.2 细胞培养

人皮肤成纤维细胞（HFF-1细胞）购自美国典型培养物保藏中心。HFF-1细胞在含有10%胎牛血清、1%丙酮酸钠、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中于37°C和5% CO2下培养，然后取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 细胞存活率检测

将HFF-1细胞（5×103/well）铺于96孔板，待融合度达到80%后，用无血清培养基、不同浓度（5， 10， 20 μg/mL）的Growgx酵母发酵产物提取物于37℃，5% CO2下培养24 h，然后将培养基吸去，PBS温和清洗细胞两次后，每孔中加入200 μL的PBS将单层细胞覆盖。随后使用UVA辐照仪SS-01放于细胞板上方，辐照剂量为10.8 J/cm2，然后除去PBS，加入无血清培养基继续培养4 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），使用酶标仪检测细胞的存活率。

1.4 细胞内ROS水平检测

将HFF-1细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁融合至80%后，用无血清培养基、不同浓度（5， 10， 20 μg/mL）的Growgx酵母发酵产物提取物于37℃，5% CO2下培养24 h。然后使用UVA辐照仪SS-01按照1.1方法对HFF-1细胞进行UVA光老化诱导。建模结束后，除去PBS，加入无血清培养基继续培养4 h，按照活性氧检测试剂盒的说明书，向每孔中加入5 μmol/L探针，于37℃条件下孵育30 min，期间每隔5 min轻轻混匀一下，使探针与细胞充分作用。随后，用预冷的PBS冲洗2次，每次5 min，以除去未进入细胞内的探针。收集细胞，采用流式细胞仪对探针含量进行检测（激发光488 nm，发射光525 nm）。

1.5 Western blotting检测Collagen I和MMP-1的蛋白表达

将HFF-1细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁融合至80%时，用无血清培养基、不同浓度的Growgx酵母发酵产物提取物（5， 10， 20 μg/mL）于37℃，5% CO2下培养24 h。使用UVA辐照仪SS-01按照1.1方法，进行UVA诱导。建模结束后，除去PBS，加入无血清培养基继续培养4 h，收集细胞，并使用裂解缓冲液（RIPA裂解缓冲液补充有1%苯甲磺酰氟）裂解细胞，然后将裂解好的细胞在4°C下以12，000 rpm离心10 min，收集上清液。根据目的蛋白的分子量，取等量的蛋白样品用10%电泳胶分离并转移至硝酸纤维素膜上，然后将膜放置在含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭1.5 h。封闭后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。第二天，使用TBST缓冲液冲洗3次后，膜与二抗于室温下孵育2 h。蛋白条带图像由全自动化学发光图像分析系统捕获，并通过Quantity One软件量化蛋白质条带的强度。

1.6 数据分析处理

使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software， Inc.， La Jolla， CA， USA）软件对数据进行分析，数据表示为至少3次独立实验的算术平均值±平均值标准误差（Standard error of mean， S.E.M.）。使用单向方差分析和Tukey事后检验来评估两组数据之间的统计学差异。P值小于0.05 （P< 0.05）表明有差异有统计学意义。

2 结果

2.1Growgx酵母发酵产物提取物通过提高细胞衰老模型中细胞存活率抗皮肤衰老

为了研究Growgx酵母发酵产物提取物对细胞衰老模型中细胞存活率的影响，我们使用MTT法检测细胞存活率。如图1所示，与空白对照组相比，在剂量为10.8 J/cm2的UVA照射下可以导致HFF-1细胞的存活率显著降低（p< 0.01），其存活率为对照组的78.84%。而Growgx酵母发酵产物提取物作用下能够显著提高UVA诱导的细胞衰老模型中细胞的存活率，其中随着浓度的升高，依次为对照组的92.26%、97.18%和99.92%，其中浓度为20 μg/mL的Growgx酵母发酵产物提取物提高细胞存活率的能力最强（p< 0.01），几乎可以阻止UVA诱导细胞的死亡。说明Growgx酵母发酵产物提取物具有抑制UVA诱导的皮肤成纤维细胞死亡的作用。

2.2 Growgx酵母发酵产物提取物通过抑制细胞衰老模型中ROS的表达水平抗皮肤衰老

为了研究Growgx酵母发酵产物提取物对细胞衰老模型中ROS表达含量的影响，我们使用流式细胞仪检测细胞中的ROS含量。如图2所示，在没有UVA照射的情况下ROS表达含量为1343.75，而在剂量为10.8 J/cm2的UVA照射下会显著升高细胞内ROS的表达含量（p< 0.01），其ROS含量为2294.25。与此同时，在Growgx酵母发酵产物提取物的作用下能够显著降低细胞内ROS的表达含量，其随着浓度的升高，依次降低ROS含量至1906.75、1716.25和1296，其中浓度为20μg/ml的Growgx酵母发酵产物提取物降低作用最强（p< 0.01），可以恢复ROS至正常水平。以上说明Growgx酵母发酵产物提取物可以降低皮肤成纤维细胞中ROS的表达含量从而抗皮肤的衰老。

2.3Growgx酵母发酵产物提取物能够上调Collagen I和下调MMP-1的蛋白表达抗皮肤衰老

为了研究Growgx酵母发酵产物提取物对细胞衰老模型中Collagen I和MMP-1蛋白表达的影响，我们使用Western blotting检测细胞中的Collagen I和MMP-1表达水平。结果如图3所示，正常情况下Collagen I和MMP-1的蛋白水平分别为1.11和0.97，在剂量为10.8 J/cm2的UVA照射后，Collagen I表达含量显著降低至0.80（p< 0.05）、MMP-1的表达显著升高至1.44（p< 0.01），而Growgx酵母发酵产物提取物可以逆转Collagen I表达下调和MMP-1表达上调的作用，其随着浓度的升高，依次显著升高Collagen I表达水平至1.05、1.04和1.07，降低MMP-1表达水平至1.09、0.82和0.80，且浓度为20 μg/mL时，即可将Collagen-1和MMP-1表达含量恢复与正常水平相一致（p< 0.01）。说明Growgx酵母发酵产物提取物通过上调Collagen I和下调MMP-1的蛋白表达抗皮肤衰老。

3  讨论

皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，导致皮肤对机体的防护能力、调节能力等减退，不能适应内外环境的变化，以及出現颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤老化是由多种因素引起的，包括体内激素失衡和体外环境过度刺激，其中紫外线辐射主要原因之一。研究发现，紫外线（UVA和UVB）的辐照下可以导致皮肤发生老化。然而有趣的是，丹参提取物可以抑制UVB辐射诱导细胞老化。儿茶素可以抑制TNF-α诱导的皮肤衰老。另外，芹菜素可抑制UVA介导HaCaT细胞的衰老。一致的，在本研究中发现Growgx酵母发酵产物提取物可以抑制UVA介导体外皮肤衰老。

综上所述，Growgx酵母发酵产物提取物能够抑制UVA辐射引起体外皮肤衰老。由此可以推测Growgx酵母发酵产物提取物可以作为抑制光老化的活性物质。本研究仅能说明Growgx酵母发酵产物提取物通过调节ROS、MMP-1和Collagen I的表达抑制皮肤衰老，尚不清楚ROS、MMP-1、Collagen I三者之间的具体联系以及Growgx酵母发酵产物提取物可能的其他作用靶点。

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