双氢青蒿素通过调节凋亡相关蛋白的表达及活性氧的产生而抑制胰腺癌JF305细胞的增殖

李亚巍+张巍+许娜+李妍+张红+吕士杰+朱文赫

[摘要]探討双氢青蒿素诱导人胰腺癌JF305细胞凋亡作用及活性氧在双氢青蒿素诱导JF305细胞凋亡中的作用。采用MTT法考察不同浓度双氢青蒿素对人胰腺癌JF305细胞增殖的影响，流式细胞术检测细胞周期，Hochest 333258荧光染色法观察细胞凋亡形态，Annexin V荧光染色法检测JF305细胞凋亡的变化，DCFHDA检测凋亡过程中活性氧（ROS）的变化。Western blot检测细胞内Bax，Bcl2，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表达的变化。与对照相比，双氢青蒿素作用JF305细胞48 h，细胞增殖受到明显抑制（P<005）；细胞被阻滞于G2/M期；细胞出现核浓缩聚集、碎裂的凋亡形态，细胞凋亡比例升高（P<005）；DCFHDA检测双氢青蒿素给药组细胞ROS明显升高（P<005）；Western blot结果显示，双氢青蒿素作用后细胞内Bcl2蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，Bax/Bcl2蛋白表达比例升高，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C 蛋白表达升高。双氢青蒿素能诱导JF305细胞凋亡，其凋亡过程可能与ROS的生成增加相关。

[关键词]双氢青蒿素； 胰腺癌； 细胞凋亡； 活性氧； 线粒体凋亡

Dihydroartemisinin inhibits proliferation of pancreatic cancer JF305

cells by regulating expression of apoptosis related proteins and

production of reactive oxygen species

LI Yawei， ZHANG Wei， XU Na， LI Yan， ZHANG Hong， LV Shijie， ZHU Wenhe*

（Jilin Medical College， Jilin 132013， China）

[Abstract]To investigate the effect of dihydroartemisinin on apoptosis of human pancreatic cancer cell line JF305 and the role of reactive oxygen species（ROS） in the apoptosis of JF305 cells induced by dihydroartemisinin MTT assays were used to detect effect of different concentrations of dihydroartemisinin on cells proliferation of JF305 lines Cell cycle was detected by flow cytometry， and the apoptotic morphology was observed by Hoechst 333258 fluorescence staining Annexin V fluorescence staining was used to detect the apoptosis changes of JF305 cells， while DCFHDA was used to detect the changes of ROS during apoptosis process Western blot was used to detect the protein expression changes of Bax， Bcl2， Cleaved caspase3， Cleaved caspase9 and Cyto C As compared with the control group， the JF305 cells proliferation was inhibited significantly（P<005） after treatment with different concentrations of dihydroartemisimin for 48 h； cell cycle was blocked in the G2/M phase； apoptotic morphology of nuclear condensation， aggregation， and fragmentation was found， and the apoptosis ratio was increased（P<005） DCFHDA detection showed that the cell ROS was increased significantly after dihydroartemisinin treatment（P<005） Western blot results showed that the expression of Bcl2 protein was downregulated； the expression of Bax protein was upregulated； the ration of Bax/Bcl2 was increased and the protein expression levels of Cleaved caspase3， Cleaved caspase9 and Cyto C were increased after dihydroartemisinin treatment Therefore， dihydroartemisinin could induce apoptosis of JF305 cells， and the possible mechanism may be related to the formation and increasing of ROS

[Key words]dihydroartemisinin； pancreatic cancer； apoptosis； reactive oxygen species； mitochondrial apoptosis

胰腺癌是我国较常见的恶性肿瘤，治疗目前主要以放、化疗为主，但是副作用较大[12]。因此，迫切需要寻找新的胰腺癌治疗策略与药物。青篙素是我国学者从中药青篙中提取的含有过氧基团的倍半萜内酯药物，由于其高效低毒，能杀灭多重耐药疟原虫，而广泛应用于恶性疟疾的治疗[34]。双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素类化合物体内主要活性代谢物之一。近年研究发现[5]，双氢青蒿素除了具有抗疟疾作用外，可选择性杀伤肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长，且毒副作用小，在抗肿瘤方面有着良好的应用前景。Singh等[6]研究发现，DHA可选择性抑制乳腺癌细胞的生长，而对正常乳腺细胞无影响。DHA还可以下调肺癌细胞中HIF1α和血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平，降低肿瘤微血管密度[7]。研究显示[8]，DHA可显著抑制HO8910PM高转细胞株磷酸化黏着斑激酶（pFAK）的表达水平，但对总FAK水平无影响。提示DHA 可能通过FAK 途径，抑制卵巢癌转移。

虽然双氢青蒿素在肿瘤治疗中展现了潜在的引用价值，但是关于双氢青蒿素对胰腺癌细胞增殖抑制作用及机制研究相关报道非常少。因此，本研究以人胰腺癌细胞JF305为研究对象，探讨双氢青蒿素对JF305增殖的抑制作用及其机制，为双氢青蒿素在临床胰腺癌治疗中的应用奠定理论基础。

1材料

人胰腺癌细胞JF305购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由吉林医药学院生物化学教研室保存。细胞培养于含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg链霉素的RPMI1640培养液中，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。每2 d更换培养液1次，待细胞长满至培养瓶底，以025%胰酶消化传代。

双氢青蒿素购于Sigma公司；Bax，Bcl2，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C抗体购于Santa Cruz公司；BCA（bicinchoninic acid）蛋白浓度测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；Muse细胞分析仪购于默克密理博公司；550酶标仪购于美国BIORAD公司；CKX41A32PH倒置显微镜购于奥林巴斯公司。

2方法

21MTT法测定细胞增殖取对数生长期的JF305细胞，吸去细胞培养液，025%胰酶消化并用培养液调整细胞数至5×104个/mL。以每孔200 μL接种于96孔板中，常规培养。待细胞贴壁后，给药组分别给予浓度为40，80，160，240，320，480 μmol·L-1的双氢青蒿素，对照组加入培养液，实验组及对照组每孔各200 μL，每组设5复孔，继续培养48 h，按照20 μL/孔加入MTT，37 ℃继续培养4 h。吸弃培养孔内上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡摇匀，在酶标仪上以波长490 nm 测各孔的吸光度A490。细胞生长抑制率= （1–A实验组/A对照组）×100%。

22流式细胞术检测细胞周期取对数生长期JF305细胞，025%胰酶消化后，按照10×105个/mL浓度接种于6孔板，24 h后分别加入不同浓度的双氢青蒿素，培养48 h后，消化收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清。预冷浓度为001 mol·L-1 PBS重悬细胞，离心、洗涤2次，用体积分数为70% 乙醇4 ℃固定过夜。PI避光染色30 min，检测细胞周期。

23Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡形态取双氢青蒿素处理48 h后的JF305细胞，加入05 mL 4%多聚甲醛固定液，室温固定10 min。弃去固定液，用PBS洗2遍，3 min/次，吸尽液体。加入05 mL Hoechst 33258染色液，室温避光染色5 min。用PBS洗2遍，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态的改变。

24细胞分析仪检测凋亡双氢青蒿素作用于JF305细胞48 h后，025%胰酶消化，收集细胞，离心后，PBS清洗2次，加入200 μL结合缓冲液（binding buffer）和5 μL膜联蛋白（Annexin） Ⅴ，室温避光30 min，加入5 μL碘化丙啶（PI），避光反应5 min流式细胞仪双色分别分析早期凋亡（AnnexinV单阳性细胞）及中晚期凋亡细胞（AnnexinV、PI双阳性细胞）占总细胞比例。

25JF305细胞内活性氧（ROS）水平检测DCFHDA自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在的情况下被氧化成DCF，后者的荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。收集處理后1×106个/mL JF305细胞悬液，PBS 洗涤后，加入1 mL PBS液重悬，加入25 mmol·L-1的CDFHDA液40 μL，使终浓度为100 μmol·L-1，在37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗涤后上流式细胞仪检测。

26Western blot检测凋亡相关蛋白的表达取药物处理后的JF305细胞48 h，025%胰酶消化，离心收集细胞1 000 r·min-1离心10 min，以PBS洗2次，用PIPA细胞裂解液于冰浴裂解，12 000 r·min-1离心5 min，收集上清。经BCA法进行蛋白定量后，取等量样品以12%SDSPAGE进行电泳。电泳后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，兔抗人Bax，Bcl2，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C抗体（浓度1∶1 000）孵育过夜，再以辣根过氧化酶标记的二抗封闭液孵育1 h，用ECL显影，扫描纪录。

27统计学分析实验数据均以±s表示，所有实验数据均采用SPSS 130软件处理，对照组与给药各组比较进行单因素方差分析，以P<005为差异有统计学意义。

3结果

31双氢青蒿素对JF305细胞增殖的抑制作用MTT结果显示，不同浓度双氢青蒿素作用JF305细胞48 h后，JF305细胞增殖受到明显抑制作用，且随双氢青蒿素浓度增加，抑制作用显著提高，呈现一定的剂量依赖性（P<005，图1）。

32双氢青蒿素对JF305细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示，双氢青蒿素作用于JF305细胞48 h后，细胞周期发生改变。随着药物浓度增加，G2/M期细胞比例逐渐增加。对照组G2/M期比例为1204%，而80，160，320 μmol·L-1给药组细胞G2/M期细胞比例分别为179%，2411%，2839%，同对照组相比，差异具有统计学显著性（P<005）。表明双氢青蒿素作用JF305细胞后，细胞被阻滞于G2/M期。

33双氢青蒿素对JF305细胞凋亡形態的影响Hochest 333258核染色结果显示（图2），与对照相比，双氢青蒿素给药组组的细胞凋亡明显增多，细胞染色质固缩，细胞核呈致密浓染色，且胞核变小浓集，呈现凋亡细胞的特征。

34双氢青蒿素对JF305细胞凋亡的影响流式细胞仪检测凋亡结果显示，双氢青蒿素作用JF305细胞48 h，细胞凋亡比例明显增加。对照组JF305细胞早期凋亡率为（234±080）%，与对照相比，双氢青蒿素给药组随着双氢青蒿素给药浓度的升高，JF305细胞凋亡率明显升高（P<005），早期凋亡率分别为（1386±142）%，（1821±162）%，（2487±178）%。

35双氢青蒿素对JF305细胞活性氧（ROS）水平的影响活性氧测定结果显示，与对照组相比，JF305细胞内活性氧的水平随着双氢青蒿素给药浓度的升高呈现升高趋势（P<005）。

36双氢青蒿素对JF305细胞内凋亡相关蛋白表达的影响Western blot结果显示，与对照组相比，不同浓度双氢青蒿素给药组JF305细胞Bcl2蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，Bax/Bcl2蛋白表达比例升高，为了进一步探讨其诱发JF305细胞凋亡的作用机制，检测了Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表达情况。结果显示Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表达均明显上调。上述结果表明双氢青蒿素促JF305细胞凋亡机制可能与线粒体凋亡途径相关（图3）。

4讨论

双氢青篙素是一种重要的青篙素衍生物，在临床上具有毒性较小并且疗效突出的特点，对脑疟等恶性疟疾有很好的治疗效果。近年来双氢青蒿素的抗肿瘤作用也得到了学者的广泛关注。据文献报道[910]，双氢青蒿素对胃癌、结肠癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞增殖均具有抑制作用。但是对于胰腺癌细胞，尤是其对胰腺癌细胞作用机制的研究相对较少。因此，本研究以人胰腺癌细胞JF305为研究对象，探讨双氢青蒿素抗胰腺癌的作用及其机制。

本实验首先通过MTT实验观察双氢青蒿素对JF305细胞增殖抑制作用。结果显示双氢青蒿素能抑制JF305细胞的增殖，其抑制作用随着双氢青蒿素药物浓度的升高呈现一定的剂量依赖性。细胞周期检测结果显示，双氢青蒿素作用于JF305细胞48 h后，JF305细胞G2/M期细胞比例明显增加，细胞被阻滞于G2 /M期。流式细胞仪检测凋亡结果显示，双氢青蒿素作用JF305细胞48 h后，细胞凋亡比例增加，可以判断双氢青蒿素是通过细胞凋亡方式来抑制肿瘤细胞的增殖的。细胞内ROS水平检测发现，双氢青蒿素作用后胰腺癌JF305细胞内的ROS明显增加，且在一定的浓度范围内呈浓度依赖。活性氧作为细胞代谢中不可避免的产物，能够通过介导多种信号通路以促进细胞凋亡、细胞坏死以及自噬性细胞死亡等方式发挥抗肿瘤作用。Zhao等[11]研究发现，MMPT能够抑制A549肺癌细胞生长和诱导其凋亡，而这个过程主要通过ROS依赖途径来实现，期间伴随着ROS的生成增加。而本研究结果显示，双青蒿素作用后能够促使JF305细胞内ROS的增加，并呈现一定的剂量依赖性。

活性氧是细胞凋亡的早期信号，它可作用于线粒体，促使线粒体膜通透性改变、线粒体膜电位下降、细胞色素C释放，它还能与Apaf1，caspase9前体，ATP/dATP形成凋亡体，然后召集并激活caspase9，caspase3，进而引发caspases 级联反应，使DNA 断裂，引起细胞凋亡[1214]。为了明确双氢青蒿素诱导JF305细胞凋亡的分子机制，通过Western blot检测细胞内蛋白表达的情况。结果显示，双氢青蒿素作用48 h后，JF305细胞Bcl2蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调，Bax/Bcl2蛋白表达比例升高，结果显示Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表达均明显上调。线粒体途径是由Bcl2家族成员Bcl2，Bad 等信号蛋白组成，这些信号蛋白在受到胞内的死亡信号后激活。Bcl2与另外的Bcl2 家族成员如Bax主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆作用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，引起线粒体通透性的改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素C[1517]。本研究结果表明，双氢青蒿素诱导JF305细胞凋亡的分子机制可能与改变细胞内ROS水平引起的线粒体凋亡途径相关。

综上所述，双氢青蒿素可以抑制胰腺癌JF305细胞的增殖，并能诱发细胞凋亡，其机制可能与双氢青蒿素升高JF305细胞ROS的水平引起的线粒体凋亡途径相关。本研究为双氢青蒿素在临床胰腺癌治疗奠定基础，但是具体机制任然有待进一步的研究。

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[责任编辑张宁宁]