镉胁迫对2个宁夏主栽水稻品种幼苗期抗氧化同工酶亚基及其活性的影响

黄雪妮　屈凡　马名立

摘要：为探讨2个宁夏主栽水稻品种萌发期、幼苗期对镉（Cd）胁迫的形态、生理生化响应，明确Cd污染对水稻的伤害机理，并为早期检测提供理论依据，以富源4号、宁梗28号为研究对象，于人工气候室内培养，设置3个Cd处理浓度（0、50、100 μmol/L），研究不同处理对水稻发芽率、胚芽鞘长度、胚根数、主根长的影响以及根系中活性氧类（ROS）的累积和细胞凋亡情况；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术分析Cd对4种抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）]同工酶亚基的影响。结果显示：（1）Cd毒害使根系产生大量活性氧类而诱导根尖伸长区细胞死亡，从而抑制了2个品种主根生长，但却使根数增加；（2）100 μmol/L Cd抑制了富源4号SOD同工酶亚基，导致SOD总活性下降，CAT活却显著性增强；（3）宁梗28比富源4号有较强的耐受Cd的能力。分析结果可知：胚根数的增加是宁夏水稻耐受Cd胁迫的重要措施；Cd胁迫下的SOD活性以及SOD同工酶亚基是可以用来鉴定水稻受重金属胁迫的一个重要的生理伤害指标；CAT对Cd 胁迫下的水稻起重要的抗氧化保护作用。

关键词：Cd胁迫；水稻；同工酶；活性氧（ROS）；细胞凋亡

中图分类号： S511.01 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0107-06

水稻是宁夏平原引黄灌溉区的主要粮食作物之一，也是宁夏平原重要的经济作物，大面积种植的水稻品种有宁梗系列、富源4号等[1]。但是，随着黄河沿岸经济的迅速发展，含有重金属污染物的工业废水被排入黄河，导致黄河水质不断恶化，重金属污染成为沿黄区水稻种植面临的重要问题，尤其是重金属镉（Cd）作为生物毒性极强的元素，不但在土壤中的化学活性大，而且移动性强、毒性持久。水稻是一种极易富集Cd的农作物，可以将Cd累积在籽粒部位，通过食物链的传递进入人体。“镉米”严重危及人体健康，能够致病、致癌、致病变。因此，污染区稻米产品的安全性一直受到重视[2-3]。

目前，关于水稻对Cd的吸收积累途径、Cd在水稻中的分布规律，及Cd对水稻生长发育的毒害机理等方面已有大量的报道[4-7]，Cd对水稻的生态生理效应趋于成熟。而有研究表明，不同品种的水稻对Cd的耐受性及累积性有显著差异[4]，种子萌发期既是水稻生活周期的起点，也是水稻感知外界环境的最初生命阶段，水稻种子萌发时期的生长状况直接影响水稻后期的发育和产量。目前，关于Cd在水稻生活周期不同发育阶段的效应，尤其是宁夏主栽水稻品种对重金属Cd响应方面的研究鲜有报道。笔者以宁夏主栽水稻品种宁梗28号、富源4号为研究对象，研究Cd胁迫对这2个品种的萌发率、胚芽鞘长度、主根数、根系中活性氧类（ROS）累积、根系凋亡以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）同工酶的影响，旨在探讨重金属胁迫对宁夏主栽水稻抗氧化同工酶基因表达的影响以及水稻在重金属胁迫下的抗性差异，为揭示Cd对宁夏主栽水稻品种毒害的生理机理及保障粮食安全和监测重金属污染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以宁夏主栽水稻品种富源4号、宁梗28号为试验材料，种子购于宁夏贺兰县种子公司。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻的萌发与处理 挑选大小一致、颗粒饱满的当年产水稻种子，先用蒸馏水冲洗干净，后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min，再用蒸馏水冲洗5次，于25 ℃蒸馏水中浸种4 h，让种子充分吸胀。取直径12 cm、铺有2层消毒滤纸的培养皿，将种子铺于其中，每个培养皿中均匀摆放30粒种子。对照组（CK）即非胁迫处理，每天加入10 mL灭菌水；Cd处理1每天加入10 mL 50 μmol/L Cd，处理2每天加入10 mL 100 μmol/L Cd，每个处理重复3次。将对照与各处理放置于人工气候箱中黑暗培养，温度28 ℃，湿度40%，注意通风。

1.2.2 种子萌发指标的测量 发芽期间，每天定时记录萌发数（以种子露白为发芽标准），萌发2 d开始测量胚芽鞘长度（mm），每次随机挑选15粒进行测量，计算平均值。发芽率（GR）即培养3 d时发芽种子数占种子总数的比例（%），萌发5 d后移栽至1/2 Hoagland培养液中，处理浓度不变。

1.2.3 可溶性总蛋白的提取及同工酶电泳 待幼苗生长至10 cm时，各称取0.5 g幼苗样品，在冰浴条件下在样品中加入 2 mL 酶提取液[0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH值8.0（每100 mL含0.073 g半胱氨酸、0.105 g维生素C、20.075 g EDTA-Na、10 mL甘油、5.84 mL 1 mol/L HCl）]，研磨至匀浆，于4 ℃、13 000 r/min离心20 min，上清液即为酶粗提取液，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[8]。

同工酶电泳采用北京六一生物科技有限公司生产的垂直板凝胶电泳仪。超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化物酶电泳时采用10%分离胶、5%浓缩胶。抗坏血酸过氧化物酶采用7.5%分离胶、5%浓缩胶。上样量45 μL，预电泳10 min，浓缩胶中稳定电压为80 V，进入分离胶后稳定电压为120 V，电流200 mA。于冰浴中电泳3～4 h后，当指示染料下行至距胶板末端1～2 cm 时停止电泳[9]。

1.2.3.1 同工酶染色及拍照 SOD同工酶的染色采用氮蓝四唑同工酶法[10]，POD同工酶染色采用乙酸-联苯胺法[10]，CAT同工酶染色采用淀粉法[11]，APX同工酶染色参照邵巍等的方法[12]，根据染色的酶谱计算相对迁移率Rf：

Rf=酶带迁移距离/前沿指示剂距离。

1.2.3.2 酶活性的测定 SOD活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法[13]，POD活性测定采用愈创木酚法[14]，CAT、APX活性的测定采用吴倩的方法[15]。每个处理重复3次，所得数据用GraphPadprism 5.0统计软件进行分析。

1.2.4 根系中ROS的累积及根系凋亡检测 为了检测Cd胁迫下水稻根系中ROS的累积随时间的变化情况，以富源4号的根系为材料。活性氧的检测：ROS Assay Kit，购自上海碧云天生物技术有限公司，用二甲基亚砜（DMSO）稀释成母液后保存于-20 ℃，工作液按1 ∶ 1 000的比例稀释。以用100 μmol Cd处理0、24、48、72 h的主根根尖为材料，经大量纯净水冲洗干净后，浸泡于ROS染色液中，于37 ℃温育20 min；用灭菌去离子水冲洗干净，装载于载玻片上，在荧光显微镜激发波长为480 nm的条件下观察活性氧的累积情况，每个处理重复8次。

Cd胁迫下根系细胞凋亡情况用碘化丙锭（PI）检测：碘化丙啶购自Sigma公司，是一种细胞核染料，能特异穿透死亡细胞的细胞膜而不能穿过活性细胞的细胞膜，从而达到鉴别活细胞的作用。先将PI粉末溶于灭菌水中，配制成浓度为 10 μg/mL 的母液，然后将母液用0.9% NaCl按1 ∶ 100的比例稀释成工作液。根系处理方法同ROS染色处理，步骤、时间一样，选取均匀一致的主根，浸泡在工作液中染色大约 3 min，然后用0.9% NaCl溶液冲洗干净、压片，于荧光显微镜下观察并拍照，整个过程要求在暗条件下操作，以防荧光猝灭。

2 结果与分析

2.1 结果与分析

2.1.1 水稻种子的萌发率和胚芽鞘长度 表1结果显示：与CK相比，随着Cd胁迫浓度的增加，2个品种水稻在处理3 d的发芽率没有被明显抑制，甚至Cd处理能在一定程度上促进种子的萌发，宁28的萌发率比富源4号高。培养7 d的主根长、胚根数测量统计结果发现，2个梯度的Cd处理能增加2个品种的胚根数，50 μmol/L Cd能极显著增加宁梗28根数（P<0.01），富源4号的根数也极显著增加（P 图1结果显示，在非胁迫处理下，宁梗28的胚芽鞘长度比富源4号长，50 μmol/L Cd在一定程度上能促进种子萌发、胚芽鞘生长，但是100 μmol/L Cd却能够抑制胚芽鞘生长。宁梗28的胚芽鞘长度比富源4号长，而胚芽鞘长度可以作为抗逆性的形态指标之一[16]，可见与富源4号相比，宁梗28对Cd胁迫有较强的抗逆性。

2.1.2 根系中ROS的累积及细胞凋亡检测 图2结果显示，与对照（CK）相比，100 μmol/L Cd胁迫24 h之后，根尖出现了较强的荧光，说明水稻根系中累积了较多ROS；48 h后检测发现，根尖中的ROS仍然没有及时被清除；而72 h之后荧光明显减弱。同样，PⅠ染色检测根尖细胞凋亡的结果显示，随着Cd暴露时间的延长，荧光强度明显增强，在72 h时荧光强度最大。检测结果显示，细胞凋亡部位主要发生在根尖分生区、伸长区部位，这可能是导致主根伸长生长被抑制的主要原因。

2.1.3 水稻同工酶电泳及酶活性测定结果

2.1.3.1 Cd对2个品种SOD同工酶及酶活的影响 图3-a 富源4号同工酶电泳结果显示，与对照相比，50 μmol/L Cd使SOD亚基出现了8条带，Rf值分别为0.12、0.23、0.32、0.45、0.57、0.71、0.78、0.84，并且S3、S4、S5亚基的亮度明显增强。图3-b酶活测定结果显示，低浓度Cd能够使SOD活性极显著上升（P

2.1.3.2 不同处理对POD的影响 由图4-a可知，富源4号POD同工酶电泳结果出现7条Rf值分别为0.07、0.21、0.39、0.58、0.61、0.85、0.91的酶带，随着Cd2+浓度的增加，富源4号POD亚基条带数没有变化，P4亚基的亮度稍有增加。同步酶活测定结果显示，Cd浓度的增加并没有显著性引起POD活性的变化（图4-b）。图4-c宁28的POD同工酶电泳结果也显示有7条酶带，P4亚基随着Cd2+浓度的增大而逐渐加深；POD活性没有显著性的变化（图4-d）。

这一结果表明，在Cd胁迫早期，POD并没有起到明显的抗氧化保护作用，有研究认为，POD很有可能是植物受到伤害的一个重要的生理伤害指标，是植物体内H2O2过度累积的一个重要标志。因此推测，可能水稻体内的H2O2暂时没有过度累积，因此POD活性没有显著上升。

2.1.3.3 Cd处理对水稻CAT的影响 不同浓度的Cd胁迫处理后，富源4号CAT同工酶图谱显示3条酶谱带，Rf值分别为0.12、0.18、0.29，C1、C3的亮度逐渐加大、条带加宽（图5-a）；由图5-c可知，宁梗28同工酶电泳结果也显示3条带，C2、C3亚基的亮度随着Cd浓度的增大而增强。酶活测定结果显示，100 μmol/L Cd胁迫都能使CAT活性极显著上升（P<0.01）（图5-b、图5-d）。这一结果表明，CAT在Cd胁迫下并没有被抑制，可能在抗氧化保护系统中起到比较重要的作用。

2.1.3.4 不同Cd浓度对水稻APX的影响 由图6-a、图6-b可见，富源4号的APX活性无明显变化，100 μmol/L Cd使A7亚基亮度降低。由图6-c、图6-d可见，宁梗28的APX在100 μmol/L Cd胁迫下条带亮度稍有增强， 但是在酶

活性上没有明显差异。这些结果说明，在胁迫早期，APX对Cd的响应不明显。

3 讨论

关于Cd对种子萌发及幼苗生长方面的影响已经有大量报道，杨颖丽等研究发现，低浓度Cd对种子萌发有一定的促进作用[17]，本研究结果与之相似，这可能是由于萌发初期Cd对淀粉酶活力略有提高作用，从而促进了细胞分裂[18]。而高浓度Cd对主根伸长生长的显著抑制作用可能与Cd进入细胞之后导致细胞分裂出现障碍或不正常分裂[19-20]、根系中ROS的过量累积而导致根尖细胞死亡有重要关系，说明Cd胁迫对水稻根系发育及胚芽生长有明显抑制作用，而宁梗

28、富源4号对Cd胁迫的一个重要形态响应就是增加胚根数。

抗氧化同工酶是植物体内最活跃的酶系之一，逆境胁迫可以调节同工酶基因在不同水平上表达，不良的环境因素常常引起基因的变异而导致酶结构的改变，这种改变反映在同工酶的酶谱上出现了不同数量、不同迁移率的谱带，因此同工酶的表达是遗传因子与环境因子共同作用的结果。通过对抗氧化同工酶的分析，可以初步了解宁夏水稻品种对不良环境的响应。当Cd被吸收进入水稻体内之后，刺激产生有害的过氧化物，当胁迫发生后，水稻体内的过氧化物酶系统会被激活起到保护作用；但当胁迫发生超过水稻忍受极限时，其防御措施也就相应减弱，乃至死亡。SOD第1个参与 O-2 · 的清除反应，生成H2O2、O2，在抗氧化酶类中处于重要地位。SOD活性的高低可以在一定程度上反映植物抗逆本领的强弱[21-22]，Liu等研究表明，日本忍冬具有较强的富集重金属Cd的能力，经检测发现，在重金属胁迫下忍冬体内具有较高的SOD活性[23]。而本试验结果表明，2个宁夏水稻在遭受Cd胁迫后，SOD同工酶基因在谱带数、表达量上都发生了明显的变化，SOD同工酶S3、S4亚基基因的被抑制效应，导致SOD活性在高浓度Cd胁迫下极显著地被抑制，因此推测SOD在Cd胁迫下不能起关键的抗氧化保护作用，活性氧代谢系统失调的主要产物可能为H2O2，而非 O-2 · 。

CAT在重金属抗性方面起到重要作用，能够高效地分解H2O2为H2O、O2而不需要消耗任何物质，因此能积极地响应体内H2O2累积，从而避免H2O2从过氧化物酶体扩散至细胞而造成氧化毒害。在烟草中已经发现了CAT基因编码的3种蛋白质用来清除体内产生的H2O2[24]。笔者研究发现，在SOD被抑制的情况下，CAT活性却在显著上升，CAT同工酶随着Cd浓度的升高，出现新的酶条带亚基，可能在后期将 O-2 · 、H2O2清除，从而最大限度地减少HO-的形成。

由于ROS的累积与POD的活性呈显著线性关系，MacFarlane等将POD活性的上升认为是遭受重金属胁迫的一个重要的指标[25]。本研究表明，在Cd胁迫早期，无论是同工酶电泳还是酶活检测，结果都显示POD没有明显改变，因此推测水稻幼苗中的H2O2物质未累积的较多，导致酶活基本未变。在本试验中，早期POD没有明显变化，可能与胁迫程度和CAT对ROS的积极清除有关。

4 结论

（1）Cd对水稻根系毒害主要表现在根系中ROS的累积、根尖伸长区细胞的凋亡以及根系生长被抑制，而宁夏水稻根系适应Cd胁迫的一个重要措施就是增加胚根数。（2）SOD亚基S3、S4的被抑制效应，是导致SOD活性下降的主要原因，因此Cd胁迫下SOD活性以及SOD同工酶是可以用来鉴定水稻受重金属胁迫的一个重要的生理伤害指标。（3）CAT在宁夏水稻清除Cd诱导的过氧化损伤中起到重要的作用。

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