联苯双酯对小鼠骨髓细胞辐射损伤的防护作用研究

董辉++侯沁莲+姜道利++唐卫生++田真源

[摘要] 目的 探討联苯双酯对辐射致小鼠骨髓细胞损伤的防护作用。方法 体外无菌分离小鼠骨髓细胞，联苯双酯孵育30 min后给予1 Gy照射，18 h后观察对骨髓细胞的细胞活力、细胞凋亡以及活性氧水平的影响。体内实验C57小鼠分为四组，对照组、联苯双酯组、照射组和照射给药组。其中照射组和照射给药组给予4 Gy全身照射，对照组和联苯双酯组给予假照射（0Gy）。联苯双酯组和照射给药组在受照后灌胃联苯双酯（450 mg/kg），持续给药7 d，对照组和联苯双酯组给予相同体积的生理盐水。在照射第9天取骨髓细胞，计数单侧股骨骨髓细胞数量以及观察骨髓细胞的凋亡、活性氧水平以及克隆形成能力。结果 体外实验中，联苯双酯在5 μmol/L有一定的保护作用。在给予1 Gy照射后18 h，与对照组相比，照射组细胞活力显著下降、凋亡率以及活性氧水平显著升高（P < 0.05）；与照射组比较，照射给药组中联苯双酯可提高受照骨髓细胞的细胞活力，降低骨髓细胞凋亡率和活性氧水平（P < 0.05）。体内实验中，与对照组比较，照射组可显著降低骨髓细胞计数和克隆形成能力，提高骨髓细胞活性氧水平（P < 0.05）；与照射组比较，照射给药组中联苯双酯可显著改善骨髓细胞克隆形成能力，降低骨髓细胞活性氧水平。结论 联苯双酯可降低骨髓细胞活性氧水平，对骨髓细胞辐射损伤有一定的防护作用。

[关键词] 辐射；活性氧；联苯双酯；骨髓细胞；细胞凋亡

[中图分类号] R811.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（a）-0004-05

The protective effects of dimethyl dicarboxylate biphenyl on the mice bone marrow cells exposed to irradiation

DONG Hui HOU Qinlian JIANG Daoli TANG Weisheng TIAN Zhenyuan ZHOU Zewei LI Deguan▲

Institute of Radiation Medicine，Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College，Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine，Tianjin 300192，China

[Abstract] Objective To observe the protective effects of dimethyl dicarboxylate biphenyl （DDB） on the mouse bone marrow （BM） cells in vivo and in vitro. Methods In vitro experiments，the bone marrow cells were isolated and exposed to 1 Gy irradiation after 30 min DDB treatment.Then the cell viabilities，reactive oxygen species （ROS） and apoptosis were detected after 18 h culture.In vivo experiments，the C57BL/C6 mice were divided into control group，irradiated group，DBB treated group and irradiated+DBB group.The mice in the control and DBB group received sham irradiation，and the mice in the irradiated group and the irradiated+DBB group accept 4 Gy total body irradiation. DBB was gavage administrated 450 mg/kg 7d to the mice in the DBB group and the irradiated+DBB. The same volume PBS were given to the mice in the control and irradiated group.After 4 Gy irradiation 9 day， the BM nucleated cell were counted，the ROS，apoptosis and CFU-GM of BM cells were detected. Results In vitro experiments，5 μmol/L DBB showed protective effects.Compared to the control group，the BM cells received 1Gy irradiation 18h showed cell viability decreased，the apoptosis and ROS levels increased（P < 0.05）.The BM cells injuries induced by irradiation were relieved compared to the irradiated group（P < 0.05）.In vivo experiments，the BM cells counts and CFU-GM ability in irradiated mice were decreased，the ROS levels were increased compared to those of control group（P < 0.05）.The BM cells counts and CFU-GM ability was increased，the ROS levels were decreased by DBB treatment compared to those of irradiated group. Conclusion DBB showed protective effects on the bone marrow cells irradiation injury by inhibiting ROS levels.

[Key words] Irradiation； Reactive oxygen species（ROS）； Dimethyl dicarboxylate biphenyl （DDB）； Bone marrow； Cell apoptosis

联苯双酯（dimethyl dicarboxylate biphenyl，DDB）是我国科学家在研究中药五味子中发现的一种新药，也是人工合成五味子丙素的中间产物，是临床治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤引起转氨酶升高的常用药物[1]。前期研究Li发现联苯双酯具有清除自由基活性，而Lin则进一步研究发现联苯双酯不仅能提高肿瘤化疗敏感性，还能抑制肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的凋亡率[2-3]。曹波等则研究发现联苯双酯还具有抗炎功能，能够抑制Cox-2酶以及IL-4，IL-8等炎症因子表达[4-8]。Li则发现联苯双酯还可引起损伤肝脏中SOD及GSH升高，从而治疗肝脏损伤[9]。而联苯双酯在辐射损伤中的作用未见报道。因此本文探讨联苯双酯对骨髓细胞辐射损伤的防护作用，并对其作用机制进行了初步的研究。

1 材料与方法

1.1 小鼠与分组

C57BL/6L小鼠，雄性，体重18～22 g，10～12周龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK（京）2012-0001。购买后饲养于中国医学科学院放射医学研究所SPF级动物房。

1.2 照射及给药

在体外实验中骨髓细胞的照射剂量为1.0 Gy。体内实验中小鼠按体重随机分为对照组，联苯双酯组，照射组和照射给药组，每组五只，共20只小鼠。其中对照组和联苯双酯组给予假照射（0 Gy），照射组和照射给药组给予4.0 Gy全身照射。Cammacell-40137 Cs放射源为加拿大原子能公司产品，剂量率约为1.0 Gy/min。所有小鼠在照射后当日灌胃给药。照射后每天给药1次，持续给药7 d，共给药7次。其中联苯双酯组和照射给药组小鼠的联苯双酯给药剂量为450 mg/kg。对照组和照射组的小鼠给予同等体积的生理盐水。在受照后第9天，取材进行相关体内指标检测。

1.3 试剂与仪器

联苯双酯由药物室周则卫老师赠送；培养基（RPMI1640）及小牛血清购自美国Gibco公司；克隆培养基（M3534）购自加拿大Stem cell公司；活性氧试剂（S0033）购自南京碧云天公司；Annexin V凋亡试剂盒购自美国Ebioscience公司；Cell Titer-BlueTM试剂购自美国Promega公司。日本Olympus倒置显微镜，日本Sysmex poch-100i全自动血液分析仪，美国Thermo CO2培养箱。

1.4 细胞活力测定

脱颈处死小鼠，无菌取小鼠双侧股骨。将骨髓细胞悬液接种96孔板，加入联苯双酯。孵育30 min后，给予1.0 Gy照射，培养18 h检测细胞活力。

1.5 细胞凋亡检测

将骨髓细胞按照凋亡试剂盒说明加入Annexin V和PI。室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测。

1.6 单侧股骨有核细胞计数

无菌取小鼠胫腓骨，反复冲洗三次。用细胞计数仪计数，结果表示为×106/femur。

1.7 细胞活性氧检测

骨髓细胞加入活性氧检测试剂后37℃水浴30 min，用流式细胞仪检测。

1.8 集落形成能力测定

无菌收集小鼠骨髓细胞，计数。每组取16×104细胞加入到4 mL M3534培养基中，种24孔板。将24孔板置入37℃，5%CO2培养箱中培养。在培养第5天计数，克隆细胞数≥30为阳性集落，CFU-GM以每2×104个细胞形成的集落数表示。

1.9 统计学处理

采用统计学软件SPSS15.0进行数据分析。正态分布计量资料以（x±s）表示。多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 联苯双酯对小鼠骨髓细胞活力的影响

观察联苯双酯对骨髓细胞活力的影响（图1A）。与0组相比，在0.5～5 μmol/L浓度下，联苯双酯对骨髓细胞有一定的保护作用，在5 μmol/L浓度有显著保护作用（P < 0.05）；当联苯双酯浓度50 μmol/L及以上时，可显著减低骨髓细胞的细胞活力（P < 0.05）。观察联苯双酯对体外受照骨髓细胞细胞活力的作用（图1B）。与对照组相比，照射组和照射给药组骨髓细胞活力显著下降（P < 0.05）。与照射组相比，照射给药组中骨髓细胞活力有明显升高（P < 0.05），表明聯苯双酯在体外可显著降低辐射对骨髓细胞的辐射损伤。

2.2 联苯双酯对小鼠骨髓细胞数量及凋亡比例的影响

观察联苯双酯对小鼠单侧股骨有核细胞数量的影响（图2A），与对照组相比，照射可显著减低小鼠单侧股骨细胞数量；与照射组相比，照射给药组可有效缓解辐射引起的骨髓有核细胞数量的降低（P < 0.05）。在体外实验中（图2B），照射可显著提高骨髓细胞的凋亡率；联苯双酯则可显著降低照射引起的凋亡率（P < 0.05）。在体内实验中（图2C），与对照组比较，照射引起骨髓细胞凋亡率增加；而与照射组比较，照射给药组中受照小鼠骨髓细胞的凋亡率降低（P < 0.05）。以上结果表明联苯双酯可显著降低辐射引起的骨髓细胞凋亡，提高受照小鼠中的有核细胞计数。

2.3 联苯双酯对小鼠骨髓细胞活性氧水平的影响

通过体内外实验观察联苯双酯对受照骨髓细胞活性氧水平的影响。体外实验结果表明（图3A），与对照组相比辐射可显著引起骨髓细胞中活性氧的升高（P < 0.05）；而联苯双酯可显著降低受照骨髓细胞中活性氧的水平（P < 0.05）。在体内实验中（图3B），尽管辐射引起的活性氧幅度没有体外高，但与对照组相比，辐射仍可显著增加受照小鼠骨髓细胞的活性氧水平（P < 0.05）；照射给药组中小鼠骨髓细胞的活性氧水平显著低于照射组中骨髓细胞的活性氧水平（P < 0.05）。

2.4 联苯双酯对小鼠骨髓细胞克隆形成能力的影响

照射后第9天，无菌取骨髓细胞接种，进行粒单系集落形成试验（Colony forming unit granulocyte-mac？鄄rophage，CFU-GM）。与对照组相比，照射对小鼠CFU-GM具有明显的抑制作用，可引起受照小鼠骨髓细胞克隆形成能力显著下降（P < 0.05）。而与照射组相比，照射给药组则可显著提高骨髓细胞CFU-GM（P < 0.05），表明联苯双酯可提高受照小鼠骨髓细胞的克隆形成能力。见图4。

3 讨论

造血系统对辐射高度敏感，是急性放射病发病的重要基础及预防诊治的关键问题，其中骨髓细胞在造血系统中发挥重要作用[10]。近年來随着核科技的进步及广泛应用，辐射防护剂研究重新成为热点。现临床使用的细胞因子及氨磷汀均存在一些缺陷，因此寻找新的辐射防护药物成为放射医学亟待解决的问题[11-12]。研究发现白藜芦醇、黑茶、益气养阴液等单体、中药及复方均对辐射损伤有一定防护作用[13-16]。联苯双酯作为我国科学家在研究中药五味子中发现的一种新药。本文主要研究联苯双酯对骨髓细胞辐射损伤的防护作用。

本文首先观察了联苯双酯对骨髓细胞活力以及凋亡的影响。辐射可引起骨髓细胞的凋亡，造成小鼠单侧股骨有核细胞计数下降[17]。而我们结果表明，在体内外实验中，联苯双酯均可有效地缓解骨髓细胞辐射损伤，提高受照骨髓细胞活力和股骨有核细胞计数，降低骨髓细胞的凋亡比例。这提示联苯双酯对造血系统辐射损伤具有保护作用。

前期研究发现联苯双酯可引起损伤肝脏中SOD及GSH升高，对肝脏损伤有治疗作用[9]。本研究观察了联苯双酯对骨髓细胞体内外受照后活性氧水平的影响。结果表明联苯双酯在体内外实验中均可有效降低受照骨髓细胞中的活性氧水平。这可能与先前报道中联苯双酯可引起细胞中SOD以及GSH等具有清除自由基活力酶的表达有关。

在骨髓细胞中存在大量的造血干细胞与造血祖细胞，其中增造血祖细胞殖活跃，更易受到辐射损伤[18]。CFU-GM检测骨髓细胞中造血祖细胞的克隆形成能力。实验结果发现与对照组比较，照射组小鼠骨髓细胞克隆形成数显著下降，表明辐射可显著降低骨髓细胞的克隆形成能力。而与照射组相比，照射给药组小鼠骨髓细胞的克隆形成数显著升高，提示联苯双酯可对骨髓细胞的克隆形成能力有保护作用。

综上所述，电离辐射可对骨髓细胞造成损伤。我们研究发现联苯双酯不仅能够提高受照小鼠单侧股骨细胞计数和细胞活力，还能降低受照骨髓细胞中活性氧水平和细胞的克隆形成能力，表明联苯双酯有一定的辐射损伤防护效果，更深层机制有待进一步探讨。

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（收稿日期：2016-11-14 本文编辑：杜雪）