钙对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化系统的影响

韩金龙+李慧++蔺经++杨青松++常有宏

摘要：为探讨外源钙对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化系统的影响，以梨砧木杜梨幼苗为供试材料，在水培条件下，研究外源施加不同浓度的钙对200 mmol/L NaCl胁迫下其叶片抗氧化酶活性、活性氧产生、膜质过氧化和抗氧化物质含量的影响。结果显示：NaCl胁迫3 d后，杜梨叶片中超氧化物歧化酶（SOD）活性减弱，过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性增强，活性氧（O-2 · 、H2O2）和丙二醛（MDA）大量积累，抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）和抗坏血酸（AsA）合成下降。施加外源CaCl2能增强NaCl胁迫下杜梨叶片中SOD、POD、CAT、GR、GSH-Px、APX的活性，减少O-2 · 和H2O2的产生，降低脂质过氧化程度，提高GSH和AsA的含量，有效缓解盐胁迫对杜梨叶片的过氧化伤害，其中以10 μmol/L CaCl2处理效果最为显著。说明NaCl处理可对杜梨叶片造成氧化伤害，施加低浓度（5～10 μmol/L）CaCl2处理可缓解盐胁迫对杜梨叶片抗氧化系统的影响。

关键词：杜梨；钙；盐胁迫；活性氧；抗氧化酶

中图分类号： S661.201文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0245-03

收稿日期：2015-04-23

基金项目：国家自然科学基金（编号：31372051）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）5018]。

作者简介：韩金龙（1989—），男，山西霍州人，硕士研究生，主要从事果树逆境生理和分子生物学研究。E-mail：hjlong24@126.com。

通信作者：常有宏，研究员，硕士生导师，主要从事果树育种和栽培生理研究。E-mail：cyh@jaas.ac.cn。土壤盐渍化是影响农业生产与生态环境的一个重要因素。据不完全统计，世界上约有10亿hm2盐渍地，我国约占其中的3.75%，并且每年随着次生盐渍地的扩张，对我国的农业生产造成严重威胁[1]。植物在盐胁迫下最直接的影响就是抑制其生长，严重时会造成渗透胁迫和离子胁迫，破坏其细胞结构和功能，甚至导致其死亡[2]。因此，如何更好地利用开发盐渍地资源，已成为人们探讨的热点。而近些年，人们通过对外源缓冲剂研究的深入，已将其视为提高植物缓解盐胁迫的重要手段。

钙（calcium，Ca）是植物生长发育所必需的一种大量元素，在植物体内起着极其特殊的作用。它不仅能够维持细胞壁、细胞膜和膜结合蛋白的稳定性，参与调节无机离子运输，而且作为细胞内第二信使，能够将胞外信息传递给胞内，从而引起一系列的生理生化变化。目前研究发现，当植物受到逆境胁迫时，植物体细胞内的游离钙离子浓度会上升，并通过Ca2+与CaM结合，形成Ca2+-CaM复合体，再对逆境胁迫信号的感受、传递和响应，启动一系列生理生化过程，以适应外界环境[3]。同时，外源施加钙也能提高植物的抗寒性[4]、抗热性[5]和抗盐性[6]等多种抗性。本试验对盐胁迫下施加不同浓度钙离子，分析其对杜梨叶片抗氧化系统的影响，旨在为缓解梨树盐胁迫提供理论依据。

梨是世界及我国主栽果树之一。随着土壤盐渍化程度的不断加剧，严重限制了梨产业的发展。梨树主要靠嫁接来繁殖，选择抗性强的砧木对嫁接苗的生长至关重要。杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）原产于中国，将其作为嫁接苗的砧木，能够提高梨树的耐盐能力[7-8]。杜梨在盐胁迫下，通过减少Na+在根中积累和向地上部运输来适应逆境[9-10]，但在高盐胁迫下，植物仍能受到氧化胁迫等伤害[11]。本试验对盐胁迫下施加不同浓度钙离子，分析其对杜梨叶片抗氧化系统的影响，旨在为缓解梨树盐胁迫提供理论依据。

1材料与方法

1.1植物材料培养和处理

将杜梨种子埋在湿沙中至于4 ℃温度中，经3个月的低温处理后，将有胚根幼苗移植于水培系统中（培养液为Hoagland 营养液，pH值5.8），并放置于光照培养箱中，每3 d更换1次培养液。培养条件如下：光照周期16 h/8 h（光照/黑暗），光照强度300 μmol/（m2·s），培养温度（25 ± 0.5） ℃，空气相对湿度60%～70%。待植株长至8叶1心时，选择长势一致的健壮幼苗，并用蒸馏水冲洗干净，用含 200 mmol/L NaCl的Hoagland 营养液进行处理，并添加一定浓度的CaCl2母液，使其在水培系统中的浓度达到 0、5、10、50、100 μmol/L。以生长在不含NaCl和CaCl2的Hoagland 营养液中的植株作为对照。每个处理设3次重复，处理3 d后收集杜梨叶片，用于测定各种生理指标。

1.2测定指标及方法

1.2.1活性氧和丙二醛含量测定过氧化氢（H2O2）含量测定参照Patterson等的方法[12]。新鲜叶片用2 mL 预冷丙酮提取后，经5%硫酸钛处理所生成的氧化物-钛复合物黄色沉淀，用2 mmol/L H2SO4溶解后，在415 nm波长下比色测定，通过标准曲线计算叶片中H2O2含量。采用羟胺氧化法来测定超氧阴离子（O-2 · ）的产生速率[13]，单位为nmol/（g·min）。采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量[14]，单位为nmol/（g·min）。

1.2.2抗氧化酶活性测定蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[15]；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（nitroblue tretrazolium chloride，NBT）光氧化还原法，以抑制 NBT 光氧化还原50%的酶量为1个酶活性单位[16]；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性的测定采用愈创木酚法[16]，以1 min内D470 nm值变化0.01为1个酶活性单位；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性的测定参照Aebi的方法[17]，以1 min内D240 nm值变化0.1为1个酶活性单位；利用紫外分光光度法测定谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR）的活性，以 340 nm处的吸光度变化为NADPH的消耗量，计算GR活性[18]；谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性采用黄爱缨等的方法[19]测定，以每毫克蛋白质1 min使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为1个活性单位（扣除非酶促反应）。参照Nakano等的方法[20]来测定抗坏血酸过氧化物酶（ascorbic acid peroxidase，APX）的活性，以1 min内D290 nm值变化0.1为1个酶活性单位。

1.2.3抗氧化物质含量总谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量采用5，5-二巯基-2-硝基苯酸（5，5-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）法[21] 测定；抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）含量采用分光光度法测定，在红菲咯啉存在的条件下，AsA所还原的亚铁离子与其反应形成红色螯合物，通过测定D534 nm来计算AsA含量[22]。

1.3数据分析

采用Excel 2007、SPSS 16.0软件对试验数据进行分析和制作表格，并运用LSD法进行多重比较。

2结果与分析

2.1钙对盐胁迫下杜梨叶片活性氧和MDA含量的影响

由表1可以看出，在盐胁迫（200 μmol/L NaCl）处理3 d后，杜梨叶片中超氧阴离子（O-2 · ）的产生速率是对照的2.37倍，H2O2、MDA的含量分别是对照的2.24、1.64倍，这会造成植株叶片细胞活性氧代谢系统失去平衡，发生膜脂过氧化。施加5 ～ 100 μmol/L CaCl2后，O-2 · 的产生速率、H2O2和MDA的含量均随着CaCl2浓度的增加呈现先下降后升高的趋势。当CaCl2为5 ～ 10 μmol/L时，O-2 · 的产生速率、H2O2含量、MDA的含量显著降低（降低27.6%～42.8%、36.1%～42.9%、10.6%～25.0%），且10 μmol/L CaCl2处理组中，上述3个指标最低（表1）。然而，当CaCl2为50～100 μmol/L 时，反而会刺激活性氧的积累（O-2 · 产生速率和H2O2含量增加），加剧膜质过氧化（MDA积累）。

2.2钙对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化酶活性的影响

由表2可知，盐胁迫（200 μmol/L NaCl）处理3 d后，杜梨叶片中超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低（仅为对照的60.4%），而过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性均有不同程度升高（为对照的1.18～1.78倍）。这表明NaCl胁迫可轻微诱导杜梨叶片中POD、CAT、GR、GSH-Px、APX活性增强，却抑制SOD的活性。施加5 ～ 100 μmol/L CaCl2后，抗氧化酶的活性均随着CaCl2浓度的增加呈先增强后减弱的趋势。当CaCl2为 10 μmol/L 时，抗氧化酶（除APX）的活性较盐胁迫下差异最明显（为盐胁迫下的1.21～1.46倍）。然而，当CaCl2为50～100 μmol/L 时，抗氧化酶（除APX、GSH-Px）的活性较10 μmol/L CaCl2处理又显著降低，且100 μmol/L CaCl2处理与盐胁迫下相比较，抗氧化酶活性差异不显著。而当CaCl2为5 ～ 100 μmol/L时，APX的活性均没有显著差异，但均比对照显著增强。

2.3钙对盐胁迫下杜梨叶片抗氧化物质含量的影响

由表3可知，盐胁迫（200 μmol/L NaCl）处理3 d后，杜梨叶片中抗氧化物质GSH、AsA含量显著降低（仅为对照的382% ～ 44.9%），严重影响植株自身清除自由基的能力。施加5 ～ 100 μmol/L CaCl2后，抗氧化物质含量随着CaCl2浓度的增加呈现先增加后减少的趋势。当CaCl2为5～100 μmol/L 时，GSH的含量较盐胁迫下均显著提高，其中以CaCl2为10 μmol/L时差异最显著，含量为盐胁迫下的2.43倍。AsA的含量随着CaCl2浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，其中当CaCl2为10～100 μmol/L 时，AsA的含量较盐胁迫下均显著提高，且在10 μmol/L时差异最显著，含量为盐胁迫下的2.07倍。

3结论与讨论

盐胁迫会引起植物体内发生一系列生理生化的变化，影响植物的正常生理调节。钙是植物生长发育的必需元素，当植物处于盐胁迫时，细胞内的盐离子与Ca2+的吸收形成竞争作用，使得Ca2+不能被充分利用，导致植物细胞对Ca2+的紧缺。盐胁迫对植物体的伤害，主要是通过对质膜完整性和钙信号转导系统的破坏[23-24]，而添加一定浓度的外源钙能够有效缓解盐胁迫对其带来的伤害[25]。这可能是因为添加外源钙不仅能够补充植物体本身所需的钙元素，而且能够增加质膜的稳定性，恢复钙信号转导系统，同时维持细胞内的离子平衡。而钙是一种膜保护剂，能够稳定膜上的蛋白质，降低质膜透性，维持细胞内的离子区域化，使得植物细胞内的各种生理代谢正常进行，从而提高植物的耐盐性。

高浓度的钙对植物体的影响则截然相反。有研究表明，高浓度的Ca2+能够降低植物的叶绿素含量和光合强度，同时对水稻幼苗的生长产生抑制作用[26]。这可能是因为过多的钙离子积累会打破细胞内原有的营养平衡，对植物细胞造成新的离子毒害，迫使细胞产生渗透胁迫等不利于植物生长的因素。同时，高浓度的Ca2+还会引起细胞内的Ca2+浓度变化，进而在细胞内产生一系列生理生化的变化，造成膜损伤等伤害[27]。另外，虽然Ca2+与Na+的生物功能不同，但是它们的化学性质却有很多相似性，在吸收过程中会形成竞争关系，而且离子过量对植物的伤害都是一样的。本试验中添加的CaCl2在为杜梨幼苗提供了所需要的Ca2+的同时，也过量积累了NaCl胁迫中的Cl-·，加剧了植物的盐胁迫。

本试验结果表明，盐胁迫下，杜梨叶片中O-2 · 产生速率、H2O2含量和MDA含量均显著增加；同时SOD活性降低，却在不同程度上刺激了POD、CAT、GR、GSH-Px、APX的活性，使它们的活性增强；但抗氧化物质GSH、AsA的含量显著降低。而在添加5、10、50、100 μmol/L CaCl2后，它们的含量或者活性都呈一定的变化规律，且在CaCl2浓度为 10 μmol/L 时，活性氧的含量降至最低水平，有效缓解了膜脂过氧化，同时所有抗氧化酶的活性达到最高水平，抗氧化物质的含量与对照条件下差异不显著，因此，盐胁迫对杜梨叶片带来的氧化损伤也是最低的。可能是因为当CaCl2浓度为 5 μmol/L 或10 μmol/L 时，植物对钙离子吸收增多，吸收到的钙离子能与细胞膜上的相关物质结合，维持细胞膜的稳定性，降低膜透性，避免吸收更多的Na+；同时Ca2+通过对细胞内离子区域化作用，将胞内多余的Na+区隔开，从而保证细胞内各种代谢正常进行，对提高植物的耐盐性有一定的作用。当CaCl2浓度为50 μmol/L或100 μmol/L时，植物细胞内Ca2+含量增多，可能对植物细胞造成了新的离子伤害，使得活性氧含量上升，膜脂过氧化加剧，抗氧化酶的活性减弱，同时抗氧化物质含量也显著降低。这表明单纯的钙处理对植物缓解盐胁迫的能力是有限的，其具体原因还有待进一步研究。

综上所述，200 mmol/L盐胁迫能对杜梨叶片造成很大程度的氧化伤害，而施加低浓度（5～10 μmol/L）CaCl2可以有效缓解这些伤害，这可能与Ca2+在植物中能够维持细胞膜稳定性，具有离子区域化作用，作为细胞内第二信使调节植物生理代谢等作用有关。

参考文献：

[1]章文华. 植物的抗盐生理和盐害的防治[J]. 植物生理学通讯，1997，33（6）：479.

[2]Parida A K，Das A B. Salt tolerance and salinity effects on plants：a review[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2005，60（3）：324-349.

[3]Braam J，Davis R W. Rain-，wind-，and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis[J]. Cell，1990，60（3）：357-364.

[4]张燕，方力，李天飞，等. 钙对低温胁迫的烟草幼苗某些酶活性的影响[J]. 植物学通报，2002，19（3）：342-347.

[5]张建霞，李新国，孙中海. 外源钙对柑橘抗热性的相关生理生化指标的影响[J]. 华中农业大学学报，2005，24（4）：397-400.

[6]朱晓军，梁永超，杨劲松，等. 钙对盐胁迫下水稻幼苗抗氧化酶活性和膜脂过氧化作用的影响[J]. 土壤学报，2005，42（3）：453-459.

[7]Okubo M，Sakuratani T. Effects of Sodium chloride on survival and stem elongation of two Asian pear rootstock seedlings[J]. Scientia Horticulturae，2000，85（1/2）：85-90.

[8]Matsumoto K，Tamura F，Chun J P，et al. Enhancement in salt tolerance of Japanese pear by using Pyrus betulaefolia rootstock[J]. Hortic Res，2007，6（1）：47-52.

[9]Okubo M，Furukawa Y，Sakuratani T. Growth，flowering and leaf properties of pear cultivars grafted on two Asian pear rootstock see dlings under NaCl irrigation[J]. Scientia Horticulturae，2000，85（1/2）：91-101.

[10]Matsumoto K，Chun J P，Tamura F，et al. Salt tolerance in Pyrus species is linked to levels of Na and Cl translocation from roots to leaves[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，2006，75（5）：385-391.

[11]Wu Q S，Zou Y N. Adaptive responses of birch-leaved pear （Pyrus betulaefolia） seedlings to salinity stress[J]. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj：Napoca，2009，37（1）：133-138.

[12]Patterson B D，Macrae E A，Ferguson I B. Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using titanium（Ⅳ）[J]. Analytical Biochemistry，1984，139（2）：487-492.

[13]Elstner E F，Heupel A. Inhibition of nitrite formation from hydroxylammoniumchloride：a simple assay for superoxide dismutase[J]. Analytical Biochemistry，1976，70（2）：616-620.

[14]李合生. 植物生理学实验技术指导[M]. 北京：高等教育出版社，2001.

[15]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（1/2）：248-254.

[16]Ma C，Wang Z Q，Kong B B，et al. Exogenous trehalose differentially modulate antioxidant defense system in wheat callus during water deficit and subsequent recovery[J]. Plant Growth Regulation，2013，70（3）：275-285.

[17]Aebi H. Catalase in vitro[J]. Methods in Enzymology，1984，105：121-126.

[18]Ali B，Tao Q J，Zhou Y F，et al. 5-Aminolevolinic acid mitigates the cadmium-induced changes in Brassica napus as revealed by the biochemical and ultra-structural evaluation of roots[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2013，92：271-280.

[19]黄爱缨，吴珍龄. 水稻谷胱甘肽过氧化物酶的测定法[J]. 西南农业大学学报，1999，21（4）：24-27.

[20]Nakano Y，Asada K. Hydrogen peroxide is scanvenged by ascorbated specific peroxidase in spinach chloroplasts[J]. Plant & Cell Physiology，1981，22（5）：867-880.

[21]Anderson M E. Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples[J]. Methods in Enzymology，1985，113：548-555.

[22]Law M Y，Charles S A，Halliwell B.Glutathion and scorbic acid in spinach （Spinacia oleracea） chloroplast.The effect of hydrogen peroxide and of paraquat[J]. Journal of Biochemistry，1983，253：109-116.

[23]Cramer G R，Luchli A，Polito V S. Displacement of Ca by Na from the plasmalemma of root cells：a primary response to salt stress[J]. Plant Physiology，1985，79（1）：207-211.

[24]Lynch J，Polito V S，Luchli A. Salinity stress increases cytoplasmic ca activity in maize root protoplasts[J]. Plant Physiology，1989，90（4）：1271-1274.

[25]Ben A N，Megdiche W，Jiménez A，et al. The effect of calcium on the antioxidant systems in the halophyte Cakile maritima under salt stress[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2010，32（3）：453-461.

[26]周焱. Ca2+对水稻幼苗生长的影响[J]. 贵州师范大学学报：自然科学版，2002，20（3）：12-14.

[27]王勋陵，陈鑫阳，鲁晓云. 钙对臭氧伤害小麦的防护作用[J]. 西北植物学报，1993，13（3）：163-169.