干旱处理对澳洲坚果光合特性的影响

王文林++陈海生++郑树芳++谭秋锦+覃振师++黄锡云++贺鹏++汤秀华++许鹏

摘 要 为探究澳洲坚果‘桂热1号苗期对干旱的生理响应机制，研究该品种在持续干旱处理7 d的叶片含水量、光合色素含量、荧光参数、渗透调节物质和保护酶活性的变化规律。结果表明：随着干旱程度的增加，‘桂热1号土壤含水量和叶片含水量均呈逐渐下降趋势，在断水7 d最为明显。干旱导致‘桂热1号叶绿素含量显著下降，但胡萝卜素含量先升后降。光合速率在断水5和7 d下降明显，伴随着活性氧清除酶活性下降。表明，‘桂热1号对干旱的自身调控能维持5 d。

关键词 澳洲坚果 ；桂热1号 ；干旱 ；光合活性 ；活性氧

中图分类号 S664 文献标志码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.03.013

Effects of Drought on the Photosynthesis of Macadamia integrifolia

WANG Wenlin CHEN Haisheng ZHENG Shufang TAN Qiujing

QIN Zhenshi HUANG Xiyun HE Peng TANG Xiuhua XU Peng

（Guangxi Research Institute of South Subtropical Agriculture， Longcuan， Guangxi 532400）

Abstract The plants of macadamia variety‘Guire 1（Macadamia integrafolia） were treated with drought for 7 days， and their leaf water content， chlorophyll contents， fluorescence parameters， osmoregulation substance and protective enzyme activities were determined to elucidate the mechanisms of their physiological response to drought. The results showed that soil water content and leaf water content of macadamia‘Guire 1tended to decrease gradually with an increase in drought stress， most obviously at the 7th day of drought stress. Under drought stress the leaf chlorophyll content decreased significantly while the leaf β-carotene content first increased and then decreased. Both photosynthetic rate and ROS scavenging enzyme activities decreased at the days 5 and 7 under drought stress. This indicated that the macadamia Guire 1 could regulate drought stress by itself for 5 days.

Keywords Macadamia integrafolia ；‘Guire 1； drought ； photosynthetic activity ； ROS

澳洲坚果（Macadamia integrifolia Maiden & Betche.）又名昆士兰果、夏威夷果、澳洲胡桃，属山龙眼科澳洲坚果属果树[1]。干旱是植物重要的非生物胁迫之一，抑制植物生长和产量[2-3]。研究表明，干旱会影响植物线粒体的呼吸作用[4]，影响根系生长和根际养分的吸收，抑制植物生长并导致光合作用下降[5-6]。植物受到干旱胁迫后，首先是通过关闭气孔以减少蒸腾作用，进而阻碍CO2进入叶内，通过气孔和非气孔因素影响玉米叶片光合作用[7]。至今，叶绿素荧光动力学参数是快速、灵敏、无损伤的研究和探测干旱逆境对植物光合作用影响的理想方法[8-9]。在干旱胁迫下，植物体内会产生过量的活性氧，渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖和一些重要的保护酶不断积累，清除体内活性氧，降低细胞渗透压维持叶片水分含量，维持植物体内的平衡和正常代谢[10-14]。虽然，坚果类抗旱研究已有一定进展[15-16]，但相对较少。国外学者发现，干旱对澳洲坚果的发育和成熟具有显著影响，应及时灌水防止产量和品质的损失[17]。然而，坚果抗旱的生理机制尚不清楚。为了能在干旱或贫瘠地区推广该品种，本文利用‘桂热1号进行为期7 d的干旱处理，通过测定土壤含水量、叶片含水量来研究‘桂热1号受旱程度，测定叶绿素含量和叶绿素荧光动力学参数来探究干旱对‘桂热1号光合作用的影响，测定‘桂热1号体内的渗透调节物质的含量和活性变化，研究它们在干旱胁迫下所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

参试澳洲坚果品种为通过国家品种审定的‘桂热1号，为3年生嫁接繁殖苗。幼苗于6月中旬定植，随机区组设计，3个重复，每小区每品种20株。采用断水处理7 d的方法，样品采集后每隔1 d采样分析。選取生长健壮、无病虫害的成熟枝条，采集顶部往下第2轮叶1片（要求叶色好、无病虫），共80片。

1.2 方法

1.2.1 土壤和叶片含水量测定

土壤和叶片含水量测定采用烘干法。在烘干前称取土壤和叶片的鲜重，在45℃烘箱中烘干24 h后称重，计算相对含水量。公式如下：

叶片相对含水量=（鲜重-干重）×100%/鲜重；

土壤相对含水量=（鲜重-干重）×100%/鲜重。

1.2.2 叶绿素含量测定

称取一定量的叶片置于80% 5 mL冰冻丙酮中，快速研磨，在5 000 r/min转速下离心5 min，取上清。用紫外—可见分光光度计（GE UltrospecTM 2100 pro UV/Visible Spectrophotometer，USA）分别测量上清在470、645、663 nm波长下的OD值，以80%丙酮作为对照，进行3次生物学重复，按Lichtenthalerl[18]方法计算单位鲜重的叶绿素（Chl）和β-胡萝卜素（β-Car）的含量。

1.2.3 光合荧光参数测定

利用PAM-2500便携式荧光仪（Walz，Germany）测定干旱处理后的玉米叶片叶绿素荧光诱导动力学参数，先暗处理30 min再测定，可获得初始荧光F0、最大荧光FM、PSⅡ的最大光量子产量FV/ FM、处理后的最小荧光F0′、光下最大荧光 FM′、实际PSⅡ的量子产量ΦPSⅡ、光化学淬灭系数qP、非光化学荧光淬灭系数qN、非光化学荧光淬灭NP、PSⅡ天线光化学荧光淬灭系数qL、PSⅡ有效光化学量子产量Y（Ⅱ）、非调控热耗散和荧光发射的量子产量Y（NO）、光诱导非光化学荧光淬灭量子产量Y（NPQ）和相对电子传递速率ETR等参数。

1.2.4 脯氨酸和可溶性糖含量测定

脯氨酸（Pro）含量采用酸性茚三酮比色法。取适量叶片称重，再置于5 mL 3%磺基水杨酸快速研磨，沸水煮10 min，取2 mL提取液加2 mL 冰醋酸和2 mL茚三酮，水浴40 min，冷却后用4 mL甲苯震荡抽提，吸取上层甲苯相，以甲苯为对照，测定OD520值。根据脯氨酸含量（μg/g）=[（OD520-0.015 7）×5/2]/（样品鲜重×0.062 1×1 000），计算叶片单位鲜重中脯氨酸含量。

可溶性糖含量测定采用蒽酮法，取适量叶片称重，置于5 mL蒸馏水，直接沸水浴30 min，取0.5 mL上清依次加入1.5 mL蒸馏水、0.5 mL 蒽酮、5 mL 浓硫酸，水浴1 min，对照组依次加入2 mL蒸馏水、0.5 mL蒽酮、5 mL浓硫酸，水浴1 min，测OD630，进行2次生物学重复。可溶性糖的计算公式为：

可溶性糖含量（μg/g）=[（OD630-0.002 5）×5/2]/（0.675 2×1 000×样品鲜重）[19]。

1.2.5 过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性测定

过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法，称取适量的玉米叶片，置于5 mL 100 mmol/L磷酸缓冲液快速研磨，4 000 r/min，4 ℃，10 min 离心，取750 μL上清加3倍上清的现配现用反应液（10 mL磷酸缓冲液加5.6 μL愈创木酚、3.8 μL过氧化氢）测OD470，对照以750 μL的100 mmol/L磷酸缓冲液加3 倍上清反应液。

POD 酶活性（μg/min）=（△A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）

△A470：反应时间内吸光值变化；Vt：提取溶液总体积，mL；W：鲜重，g；t：反应时间，min；Vs：测定时溶液体积，mL。

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（NBT）法，称取适量的玉米叶片，置于5 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液快速研磨，1 000 r/min，4℃，20 min，向玻璃管中分别1.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩冲液、0.3 mL 130 mmol/L MET 溶液、0.3 mL 750 μmol/L NBT溶液、0.3mL 100 μmol/L EDTA-Na2 溶液、0.3 mL 20 μmol/L核黄素溶液，最后处理组加0.3 mL上清，对照组2份都加0.3 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（一支放冰箱作为对照，一支用光照），4 000 lx 光照20 min。

SOD 酶活性=[（Ack-AE）×V]/（0.5×Ack×W×Vt）

其中，Ack：照光对照管的吸光度；AE：样品管的吸光度；V：样品溶液总体积，mL；W：样品鲜重，g；Vt：测定时样品体积，mL。

1.2.6 统计分析

试验均为3次重复，采用Microsoft Excel 2013计算试验数据平均值，SAS 9.0进行差异显著性分析，作图使用origin8.0软件。

2 结果与分析

2.1 干旱对‘桂热1号土壤含水量和叶片含水量的影响

干旱对‘桂热1号土壤含水量和叶片含水量的影响见图1。从图1可看出，随着干旱天数的延长，土壤含水量从干旱第3天起显著下降，由干旱初期的48.03%下降到7 d的6.77%。叶片含水量在处理的前5 d无明显差异性变化，在处理7 d显著性下降，从干旱0 d的89.80%下降到7 d的73.65%。

2.2 干旱对‘桂热1号色素组成的影响

在干旱处理下，‘桂热1号叶片中的色素含量变化如图2所示。叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和总叶绿素（Chla+b）的变化趋势相似，在处理1 d，二者的含量均显著性下降。随着干旱程度的加重，二者的含量仍然呈现出先显著下降，再显著上升。Chla/b在处理初期含量变化不显著，在处理第5天显著下降。β-Car在处理第3天呈显著上升，随后显著下降。

2.3 干旱对‘桂热1号光合荧光参数的影响

干旱对‘桂热1号光合荧光参数的影响见图3。由图3可知，玉米在干旱胁迫下的叶绿素荧光参数的变化。F0在干旱处理的7 d中略有下降，但变化趋势不显著。应用饱和闪光后，测得的FM在干旱胁迫过程中持续减少，直到处理7 d FM显著下降。FV/FM在处理前期无显著性变化，干旱第7 天显著减少。qL、Y（NO）和qP在干旱期间无明显变化，qN在干旱第3 天显著下降，随后又显著上升，Y（NPQ）变化趋势与之相同。NPQ在处理第3天也存在下降的现象，但其在处理的第1天和第5天均显著上升。ΦPSⅡ、Y（Ⅱ）、ETR在干旱处理前期无明显变化，至第5天显著下降。

2.4 干旱对‘桂热1号抗旱相关生理指标的影响

在干旱处理的7 d中，‘桂热1号叶片中Pro含量在处理第3天显著性下降，第5天呈显著上升现象，至第7 d叶片中检测到的脯氨酸含量极低（图4）。可溶性糖的含量由处理开始的显著下降到处理第3天的最低值，再到处理第5天的显著上升，但含量始终低于处理前。POD在干旱中，其活性在胁迫开始时就显著下降，随着干旱天数的增加，POD的活性不发生显著性变化。干旱处理下，‘桂热1号叶片中SOD活性无显著性变化。

3 讨论与结论

植株对干旱胁迫的第一响应就是通过气孔关闭避开低水势，由于气孔关闭导致CO2同化量的减少，是光合作用下降的主要原因之一[20]。另一个原因是叶绿体结构发生变化[21]，光合色素降解，使光合电子传递系统遭到破坏，光合磷酸化受到抑制，引起水解酶的活性上升而合成酶的活性下降，从而导致光合速率下降[22]。Chla多位于叶片叶绿体类囊体膜PSII反应中心蛋白复合体，而Chlb多位于叶片叶绿体类囊体膜捕光色素天线蛋白复合体，二者的比值反映叶绿体类囊体结构的变化。本研究中，土壤含水量在干旱处理3 d后显著减少，Chla和Chlb含量在干旱处理开始就显著下降，在处理3 d后，其含量又显著上升，推测是植物体自身对干旱的调节作用。但Chlb含量仍比处理前的低，其降解的速率比Chla快。β-Car在干旱第3天时显著上升，但随后显著下降。说明通过β-Car吸收光能，来抵抗干旱胁迫只能维持到第3天。Chla/b在干旱前3 d无明显变化，但至第5天时显著下降，说明‘桂热1号在干旱胁迫下，光合色素的正常有效生成只能维持3 d。

干旱引起的光合速率下降和气孔关闭，都会使光合机构PSⅡ中光能过剩，导致PSⅡ活性和卡尔循环电子需求间能量的不平衡，最终损伤光合机构[20-21]。在本研究中，FM在干旱处理下持续下降，至第7天显著下降，即通过PSⅡ的电子传递发生变化。同样FV/FM也是在处理第7天显著性下降，说明PSⅡ反应中心内光能转化效率减弱。非光合化学淬灭是植物的一种自我保护机制，能够以热能的形式消耗植物体内多余的光能，防止植物在遭受环境胁迫时引发的光合结构破坏。干旱第1天 NPQ显著上升，但至第3天 qN和NPQ都显著下降。ΦPSⅡ和ETR在干旱5 d显著下降，Y（Ⅱ）在干旱3 d显著下降。说明‘桂热1号在干旱第5天时，PSⅡ反应中心已受到伤害。

当植物体内能量过剩时，会引发过量的活性氧产生，造成氧化胁迫，使膜系统受到破坏[18]。植株体内具有一套活性氧的清除体系，如渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖和一些保护酶。该体系能够清除逆境胁迫下植物体内的自由基和活性氧，维持植物体内的平衡和正常代谢。在本研究中，‘桂热1号随着干旱程度加重SOD的含量略有上升，但变化不显著。在部分植物中SOD的活性会随着胁迫的强度不断增大呈先升后降[25]，呈先降后升的趋势，或一直下降[26]，或保持不变[27]。POD在干旱初期就显著下降，随着干旱程度的加重，其含量无明显变化。在‘郑单958和‘陕单902品种中，干旱胁迫使Pro、可溶性糖、SOD、POD含量升高[28-29]。本研究中，Pro和可溶性糖的含量在土壤含水量明显减少时均显著性下降，在干旱5 d时，可溶性糖含量显著上升，但仍低于处理前的水平。这些物质的下降与植物体内的活性氧大量爆发，对植物体造成伤害。研究表明，‘桂熱1号对干旱有一定的抗性，它的耐旱性能维持5 d，农业种植时应在干旱5 d后进行灌溉。

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