TSA法多重免疫荧光染色在猴艾滋病模型病理研究中的应用

何晓妍，郑宏毅，郑永唐

（1.中国科学院昆明动物研究所，中国科学院动物模型与人类疾病机理重点实验室，云南 昆明 650223；2.中国科学院大学，北京 100049）

艾滋病（Acquired immune deficiency syndrome，AIDS）是一种由人类免疫缺陷病毒（Human immuno⁃deficiency virus，HIV）感染导致的慢性传染病［1］，严重威胁HIV携带者（People live with HIV，PLWH）的健康状况和生存质量。截至2020年底，全球约有3 800万人感染，其中2 750万人接受抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral therapy，ART）（https：//www.un⁃aids.org/en/resources/fact-sheet.）。20世纪90年代开始推广的ART依然是目前最主要的AIDS治疗手段，能够让绝大部分的HIV感染者免于发展为AIDS，并且提高预期寿命。由于被病毒潜伏感染的细胞亚群在组织中广泛分布，以及病毒与药物双重作用引发的免疫器官病变和功能障碍等因素影响，PLWH即使接受ART治疗后血浆病毒载量低于检测下限，仍难以达到功能性治愈的目标［2-4］。

了解HIV在PLWH体内持续存在的机制及其对组织免疫微环境的影响，对于AIDS治疗研究至关重要。非人灵长类动物的免疫学特征与人高度相似，是研究病毒感染机制以及治疗方法的良好动物模型［5］。猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）感染的猕猴ADIS（Simian acquired immu⁃nodeficiency disease syndrome，SAIDS）模型是研究发病机制、药物和疫苗评价、免疫治疗策略等相关研究应用最为广泛的艾滋病动物模型［6-10］。组织免疫病理在模型研究中是重要的研究手段，比如基于猕猴ADIS模型的研究发现次级淋巴结的局部组织免疫微环境在AIDS发病机制中发挥关键作用，为治愈AIDS提供了免疫学证据和新思路［11］。

传统的免疫荧光/免疫组织化学染色（Immuno⁃fluorescence/Immunohistochemistry，IF/IHC）技术能在保持福尔马林固定石蜡包埋组织（Formalin fixed and paraffin embedded tissues，FFPET）完整性的前提下，对标记物等进行亚细胞结构上的可视化研究［12-13］。随着荧光染料和成像检测技术的发展，多重免疫荧光染色（Multiple immunofluorescence stain⁃ing，MIS）技术越来越广泛地被运用［14-15］。以往的组织MIS方案通常需要不同种属的一抗进行间接标记才能完成，使实验设计受到限制。而近年来发展的酪胺信号放大技术（Tyramide signal amplification，TSA）很好地解决了这一问题［16-17］，该方法利用二抗上结合的辣根过氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）在过氧化氢的存在下催化荧光素标记的酪胺分子共价偶联到临近蛋白的酪氨酸残基，可在同一组织上获得多达7～9种生物标志物的表达及分布［18-23］，进而对组织微环境进行多维度分析［24］。然而该方法的复杂性也使获得高质量的染色结果需要大量的步骤优化［21，25-26］，否则难以作为标准化实验流程应用于病理研究。

本研究通过优化TSA法多重免疫荧光的染色条件，旨在建立一种稳定可靠的多色染色方法，并将免疫荧光图像转化为以细胞为基本单位的数字信号矩阵进行流式分析，最后应用于SAIDS模型的免疫病理研究，为艾滋病及其他疾病的免疫病理诊断和机制研究提供了一种良好的组织病理学研究手段。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

1.1.1 实验材料36份SIVmac239感染的雄性中国猕猴的淋巴结石蜡切片，其中包括快进展模型组12份，慢进展模型组12份和正常对照组12份，样本来源于本实验室以往的实验［9-10］。

1.1.2 实验试剂硼氢化钠、硫酸葡聚糖钠盐、4-碘苯酚、苏丹黑B、过氧化氢、EDTA（均购自Sigma公司）；二甲苯、无水乙醇、TRIS-HCl、柠康酸酐（购自阿拉丁公司）；QuickBlock免疫染色封闭液、QuickBlock免疫染色一抗稀释液和QuickBlock免疫组化染色二抗稀释液（购自碧云天公司）；DAPI染色液、抗荧光衰减封片剂（购自索莱宝公司）；山羊抗兔IgG-HRP、anti-CD4兔单抗、anti-Granzyme B兔单抗、anti-Bcl6兔单抗、anti-CD20兔多抗（购自Abcam公司）；anti-CD8兔单抗（购自CST公司）；酪胺-iFlu⁃or488、酪胺-Cy3、酪胺-Azido Cy5、酪胺-Pacificblue（购自AAT Bioquest公司）；anti-SIV gag P27兔多抗（由本实验室制备）。

1.2 实验方法

1.2.1 石蜡切片的染色前处理将二甲苯脱蜡和梯度酒精水化后的石蜡切片浸于抗原修复液中（0.01 M TRIS-HCl，0.001 M EDTA，0.1%柠康酸酐，pH=8），高压修复2~4 min。待冷却至室温后，取出切片，置入含0.1%硼氢化钠的TBS中清洗30 min。自来水冲洗干净后，在组织上滴上3%过氧化氢，室温处理10~20min。TBST漂洗3次，封闭液封闭30min。

1.2.2 配制TSA反应液首先配制基底液（0.1 M硼酸缓冲液，2%硫酸葡聚糖钠盐，0.1%Tween-20，pH=8.5），过滤除菌后－20℃储存备用。使用时恢复到室温，加入4-碘苯酚（50~500μg·mL-1）、H2O2（0.003%）和酪胺荧光素染料（5~20μg·mL-1）。

1.2.3 抗体孵育和染色甩掉切片上的封闭液，滴上稀释好的一抗A，室温孵育1~2 h。TBST漂洗3次后，室温孵育HRP标记的二抗（1μg·mL-1）30 min。TBST再次漂洗3次，室温孵育酪胺-iFluor488酪胺反应液5~15 min。反应结束后TBS漂洗1次，将切片置于柠檬酸（pH=6.0）溶液中，微波炉亚沸加热10 min，洗脱掉一抗和二抗。加热结束后将容器置于自来水中冷却至室温，取出切片用TBST漂洗3次，重复以上步骤3次，标记一抗B、C、D和酪胺-Cy3、酪胺-Azido Cy5、酪胺-Pacificblue。

1.2.4 封片和拍照 所有抗体染色完成后孵育DAPI染液（5μg·mL-1）3~5 min，随后滴上0.3%苏丹黑B溶液室温孵育3 min，TBS漂洗干净后用抗荧光淬灭封片剂封片。检查没有气泡后，采用徕卡DMI4000荧光显微镜或者尼康A1激光共聚焦显微镜拍摄所有荧光通道，获得高质量的荧光图像。

1.3 统计学处理

1.3.1 图像分析用ImageJ软件的DnsMacro Example插件分析图像中每个细胞的位置、大小和荧光信号，导出为数字矩阵文件。然后将该文件导入到R软件中，通过已经编辑好的程序自动进行聚类分析，鉴定出阳性表达的细胞，分析完成的数据导出为包含每个细胞相对荧光信号信息的文件。

1.3.2 数据分析使用Flowjo V10软件按照流式细胞术的方法，对组织中每个细胞的空间位置和各种蛋白的表达水平进行分析和可视化，导出标准的流式分析结果。两组之间多个变量的比较采用post-hoc ANOVA的统计学方法，P＜0.05为差异有统计学意义。数值采用平均值±标准差（-x±s）的形式。

2 结果

2.1 优化TSA法提高多重免疫荧光染色质量有多种因素会影响TSA法染色的效果，包括反应温度和时间，催化剂4-碘苯酚、氧化剂H2O2、底物酪胺分子以及一抗和二抗的类型（寡克隆、多克隆和多聚体）和浓度等。初期研究发现在按说明书使用一抗和二抗的情况下，室温下0.003%的H2O2和5μg·mL-1酪胺荧光素染料足以获得高亮度低背景的染色，影响染色效果的主要因素是反应时间和4-碘苯酚的浓度。为获得最佳反应条件，在一抗和二抗孵育结束后，对CD4抗体标记Cy3、CD8抗体标记iFluor488、CD20抗体标记Cy5，控制反应时间分为5、10、20 min 3个变量，4-碘苯酚浓度分为20、150、450μg·mL-13个变量，不同变量组合成9种模式，每种模式染色3个样本。荧光显微镜的拍照结果显示在150μg·mL-14-碘苯酚催化10 min的条件下，荧光强度最接近中位值，既没有染色过度也没有不足，是最佳染色条件（图1A）。在此条件下的图像质量高，细胞膜蛋白染色锐利清晰，每个目标细胞都能呈现完整的形状，残缺或模糊的现象极少（图1B）。

图1 TSA法荧光染色最佳条件摸索

2.2 免疫荧光图像转化为数字信号矩阵进行分析典型免疫荧光四色染色包括DAPI染料标记的细胞核和iFluor488、Cy3、Cy5标记的抗体（图2A）。对该图像进行分析，首先根据DAPI信号标记出每个细胞的位置（X，Y）和面积（Area）。再计算每个细胞区域内各个荧光信号的最大值（Max）、最小值（Min）、平均值（Mean）和中位值（Median），根据这些信号参数对细胞进行迭代自组织聚类（ISOData）。随后再进行一次K-均值聚类，将阳性细胞区分出来，根据聚类分析的结果计算每个细胞阳性信号的阈值（Threshold）。每个细胞的相对荧光强度即为：（Mean-Threshold）*Area（图2B）。最后导出数字信号矩阵由流式细胞术软件进行可视化和数据分析，不仅可以单独分析每个通道，也可以分析通道间的共表达状态（图2C）。

图2 多重免疫荧光切片的细胞水平分析方法

2.3 TSA法研究组织空间结构的病理特征为了验证该实验方法的可行性，选取了24份SIVmac239感染猕猴模型（SAIDS慢进展者和快进展者各12份）和12份健康对照猕猴的淋巴结石蜡切片，检测整个淋巴结组织上CD20、Bcl-6、CD4和CD8的表达情况（图3A）。CD4+/CD8+细胞比值与AIDS及非AIDS相关并发症的发生相关，并能有效预测长期ART疗效，是评估PLWH疾病进程和治疗情况的良好的预后指标［27-29］。根据B细胞标志物CD20圈定滤泡（Follicle）区域、Bcl-6圈定生发中心（Germinal center，GC）区域，本研究将整个淋巴结组织划分为滤泡区、非滤泡（Non-follicle）区和GC区3个区域，分别统计和分析CD4+/CD8+细胞比值（图3B）。

统计结果表明在淋巴结滤泡区域，SAIDS快进展者［（1.29±0.63）%，P＜0.000 1］和慢进展者［（1.54±0.73）%，P=0.000 2］的CD4+/CD8+细胞比值差异无统计学意义，但是显著低于健康对照［（4.23±2.66）%］。在生发中心区域，相较于健康对照［（6.61±5.92）%］的CD4+/CD8+细胞比值，快进展者［（2.34±3.11）%，P＜0.000 1］和 慢 进 展 者［（3.59±2.89）%，P＜0.000 1］都更低（图3C）。荧光图像显示SIV感染导致CD8+细胞大量浸润这两个区域（图3B），SAIDS快进展者生发中心的CD4+/CD8+细胞比值还要显著低于慢进展者（P=0.019 0）。

健康对照样本生发中心区域的CD4+/CD8+细胞比值［（9.85±6.70）%］与非滤泡区［（2.93±2.86）%，P＜0.000 1］和滤泡区［（4.30±2.70）%，P=0.000 2］相比差异显著。SIV感染后，慢进展者生发中心区域的CD4+/CD8+细胞比值［（3.57±2.91）%］依然高于非滤泡区［（1.64±1.08）%，P=0.006 8］和滤泡区［（1.54±0.73）%，P=0.004 2］，但是3个区域间的差异已经有所缩小。而随着AIDS疾病进展，CD8+细胞大量浸润淋巴结的滤泡和生发中心区域，快进展者的3个区域CD4+/CD8+细胞比值无显著差异（图3D）。

图3 SIV感染猕猴模型淋巴结主要空间结构的CD4和CD8表达特征

2.4 TSA法在组织水平研究蛋白的共表达特征为了进一步探究浸润次级淋巴滤泡的CD8+细胞对SIV感染的影响，设计了以下两组染色：一组检测滤泡区的CD8与颗粒酶B表达，另外一组检测整个淋巴结水平上SIVgag p27、CD8和CD4的表达（图4A）。统计结果表明，快进展者淋巴滤泡的CD8+细胞［（16.32±7.22）%，P＜0.000 1］和表达颗粒酶B的CD8+细胞［（6.80±3.26）%，P=0.003 7］，以及整个淋巴结的CD8+细胞［（18.75±7.06）%，P=0.009 4］、病毒感染细胞［（19.88±9.22）%，P＜0.000 1］和病毒感染的CD4+细胞［（15.86±8.44）%，P＜0.000 1］相对于 慢 进展者［（9.10±6.56）%；（3.21±3.33）%；（11.05±6.89）%；（3.37±2.98）%；（1.69±1.27）%］显著增加（图4B）。结果表明，随着疾病进展，淋巴结组织的CD4+细胞受到更为严重的感染，CD8+细胞大量浸润滤泡并且异常高表达分泌颗粒酶B。

图4 SIV感染猕猴模型淋巴结和淋巴滤泡的免疫病理特征

3 讨论

本研究优化TSA多色荧光染色方法，开发配套的定量分析算法，并应用于SAIDS模型淋巴结的免疫病理研究。染色分析结果表明SIV感染导致CD8+细胞浸润次级淋巴滤泡，SAIDS快进展者的CD8+细胞浸润相比慢进展者更为严重。同时相比于慢进展者，高表达颗粒酶B的滤泡CD8+细胞和感染SIV病毒的CD4+细胞在快进展者淋巴结也更多，显示出更为严重的免疫病理。

与先前的研究相一致，本研究也发现病理性的SIV感染诱导具有更强杀伤潜力的CD8+细胞大量浸润淋巴滤泡［30-31］，以及SIV感染显著降低了外周血和淋巴结中CD4+细胞的比例和CD4+/CD8+细胞比值［32］。然而，也有研究表明，从急性到慢性感染的过渡过程中，血液和组织病毒库部位的SIV特异性CTL的复制活性更低并且失去溶细胞功能［33］。次级淋巴结组织中CD8+细胞的免疫活化在病毒复制和CD4+/CD8+细胞比值倒置中的作用尚未清楚［32］，需更进一步的研究和探索。未来的AIDS治疗策略，旨在逆转淋巴组织中CD4+细胞的耗竭，优化CTL的抗病毒活性，最终减少或消除潜伏的HIV［34］。本研究的染色结果显示淋巴结的免疫病理特征与SIV感染的疾病进展相一致，应用TSA法研究SIV感染猕猴模型的免疫病理机制研究有助于新一代AIDS药物开发。

传统IHC/IF多重免疫荧光染色存在许多局限性，需使用不同种属来源的一抗，因而很难进行多标志物的检测和相关性分析。此外，病理研究者通过肉眼观察和半定量地判读图像结果具有较强的主观性。而TSA法多重免疫荧光染色优势在于：（1）对一抗的种属来源没有限制，因而可以全部使用效果最好的兔单克隆抗体；（2）可识别传统IHC/IF难以检测和评估的弱表达抗原［14，35］；（3）良好的染色质量和信噪比；（4）可对组织特异性结构和感兴趣的区域进行定量分析［36］；（5）多通路复用可高效利用组织，节省有限的病理资源［37］；（6）通过多参数分析对组织有更深层次的洞察，揭示隐藏的生物学信息［38］。然而该方法步骤繁琐，对一抗要求高，最好是选择单克隆抗体进行染色［39］。荧光光谱的重叠也可能导致多个靶标的荧光信号混合，很难用肉眼分辨染色信号，更依赖于专业的图像分析算法［40-41］。目前新型荧光染料的开发及光谱成像系统的改进，将更加有利于发挥TSA法的优势［35，42］。当然，该方法也适用于其他疾病的病理研究，尤其适合在发病早期阶段进行预测，高灵敏和高数据维度的优势有利于关键信号蛋白的分析［43］。

相比原始的TSA法多重荧光染色方法［16-17］，本研究从抗原修复、TSA反应液成分配比、染色步骤到封闭自发荧光等步骤对整套染色过程进行了系统性改良。不同于标准的组织修复步骤［40，44］，本研究在抗体修复液中添加柠康酸酐成分，能更深度地对抗原进行修复，适用于状态不理想的组织。甚至已经在4%多聚甲醛中浸泡5年以上的组织，使用该修复方法依然能够获得良好的染色效果。本研究对TSA反应液的成分进行了长期的探索，确定了最佳的配方成分和比例，经优化后的反应液配比具有稳定可靠、低成本的优点，只需要不到1/5的成本就能获得不亚于商品化试剂的染色效果。基于PerkinElmer公司的“Opal Multiplex IHCAssay Development Guide”中推荐的抗体洗脱策略，在保持FFPE样本的组织完整性和抗原活性的前提下，通过微波加热亚沸的柠檬酸缓冲液（pH6.0）能高效完整地洗脱残留的抗体。通过设置阳性对照和阴性对照以避免组织自发荧光的干扰［40，45］，获得更清晰的信号，同时通过苏丹黑B处理组织切片，可以有效封闭组织中脂褐质的自发荧光［46-47］，避免出现假阳性结果。最后本研究还开发了配套的定量分析算法，利用开源软件进行科学准确的数字图像分析。

综上所述，本研究新建立的TSA法多重免疫荧光染色和标准化图像分析平台可客观地检测和定量分析多种标记物在组织中的空间表达和共表达特征，提供了更多维度的病理分析数据，将成为发现疾病病理特征的有力工具，在AIDS及其他疾病发病机制的研究应用中具有广阔前景。