三氟淫羊藿素通过α7nAChR抑制完全弗氏佐剂诱导脊髓小胶质细胞的激活作用

孙亚兰，贾丹丹，黄 诚

（1.赣南医学院2018级硕士研究生；2.赣南医学院2019级硕士研究生；3.赣南医学院基础医学院；4.疼痛医学研究所，江西 赣州 341000）

慢性炎性痛不仅给患者带来生理和心理痛苦，还给卫生保健系统带来巨大压力，成为一个主要的公共健康问题［1］。目前，用于治疗慢性炎性痛的药物，如阿片类药物和非甾体类抗炎药物等，其不良反应大且治疗效果不佳［2］，因此寻求安全且不良反应少的治疗药物是亟待解决的临床问题。有研究显示，植物雌激素可缓解神经病理性痛大鼠的痛敏行为［3］。而三氟淫羊藿素（Trifluoro-icaritin，ICTF）与雌激素结构类似，且长期使用不良反应少［4］，但其对完全弗氏佐剂（Complete Freund's adjuvant，CFA）诱导慢性炎性痛大鼠的作用及其机制有待进一步研究加以阐明。有文献报道，小胶质细胞是中枢神经系统的驻留巨噬细胞，而CFA可激活脊髓小胶质细胞产生大量的炎症介质进而诱发慢性炎性痛［5-6］。越来越多的证据表明小胶质细胞引发的神经炎症在慢性炎性痛发生发展中的重要性，这提示抑制小胶质细胞的激活可能是一种治疗慢性炎性痛的新策略［7-8］。有研究表明，α7烟碱型胆碱能受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）作为胆碱能抗炎通路的关键受体可表达在小胶质细胞上并参与抑制慢性炎性痛的发生发展［9］。而植物雌激素可通过抑制小胶质细胞的活化发挥神经保护作用［10］。因此，本实验将探讨ICTF是否可通过α7nAChR抑制小胶质细胞的激活来缓解慢性炎性痛？这将为慢性炎性痛的治疗提供新药物及思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组SPF级雄性SD大鼠，体重150~170 g（6~8 w），由湖南斯莱克景达实验动物有限公司［许可证号：SCXK（湘）2016-0002］提供。饲养在12 h光照/12 h黑暗、舒适和安静的环境中，且保持室温（24±1）℃。大鼠在实验期间可自由获取食物和水。待大鼠适应环境5 d后，首先将大鼠随机分为3个组：Ctrl组（n=4）、CFA组（n=4）和CFA＋ICTF组（n=4）。给予CFA＋ICTF大鼠腹腔注射ICTF（3 mg·kg-1），连续注射21 d。然后，将大鼠随机分为2个组：CFA＋ICTF＋PBS组（n=6）和CFA＋ICTF＋α-Bgtx组（n=6）。大鼠提前5 d进行鞘内置管，给予CFA大鼠腹腔注射ICTF（3 mg·kg-1）共21 d，并于第14 d开始分别鞘内注射PBS和α7nAChR的抑制剂α-Bgtx，每天1次连续7 d，并于第21 d取材。所有大鼠的研究行为均严格遵守赣南医学院动物伦理委员会要求。

1.2 仪器设备和化学试剂Cycler梯度PCR仪（中国，其林贝尔），荧光定量PCR仪（美国，赛默飞世尔科技）电泳槽和转膜仪器（美国，Bio-Rad），化学发光成像系统AI600（美国，GE），ICTF（上海辰香医药科技有限公司，CX190625001），兔抗CD11b IgG（1∶1 000，Abcam，ab133357），CFA（Sigma，SLCC3348），α-Bgtx（1μg·mL-1，Abcam，ab120542），鼠抗GAPDH（1∶1 000，Solarbio，M1000140），DMSO（Solarbio，D3870）。

1.3 制备慢性炎性痛大鼠模型应用异氟烷（2%~3%）对SD大鼠实行吸入麻醉，当SD大鼠出现麻醉状态时（掐尾巴无反应），将麻醉的SD大鼠摆放为右侧卧位，充分暴露左后肢，用碘伏消毒后于单侧左后足底注射100μL CFA（整个过程中注意观察SD大鼠的呼吸情况），注射完毕后停止麻醉，待其清醒后放回笼中以备后续实验。

1.4 鞘内置管及给药大鼠适应环境5 d后，实验采用异氟烷麻醉，大鼠在持续麻醉状态下先进行备皮，充分暴露皮肤，用碘伏消毒后沿背部正中切开皮肤约1.5 cm，钝性分离筋膜充分暴露肌肉组织，于L4/L5椎间隙处进行穿刺，在穿刺过程中大鼠出现甩尾现象后将针管向下压再用小镊子推送PE-10导管（置入长度约3.5 cm），将PE-10导管固定于肌肉组织，并沿背部皮下穿刺固定于大鼠大脑正中。在伤口处给予青霉素钠，并缝合皮肤。置管4 d后剔除置管不成功的鼠，置管5 d后进行CFA造模，并于当天下午6∶30开始腹腔注射ICTF，以后在每天下午6∶30注射ICTF连续给药共21 d。于第14 d鞘内注射α-Bgtx（先腹腔注射ICTF，半小时后连续注射1μg·kg-1的α-Bgtx，共7 d）。

1.5 qRT-PCR检测在第21 d取材，将L4~L6段左侧脊髓组织置入1.5 mL的无酶的EP管，加入200μL Trizol充分将脊髓组织进行匀浆，再加入800μL Trizol，上下颠倒10次后静置5 min；每个EP管内加200μL的氯仿剧烈震动20 s，静置2 min，接着4℃，12 000×g，离心10 min。吸取上清液并加入等量异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，4℃，12 000×g，离心10 min。DEPC水配置75%的乙醇用于洗涤沉底，洗涤后4℃，12 000×g，离心5 min，离心完倒掉洗涤后的乙醇，进行干燥。待干燥完成后，使用约20μL的RNase Free的水溶解定量。进行后续逆转录实验，逆转录完成后，进行实时定量PCR实验。qRT-PCR反应体系：cDNA 2μL，1×SYBR 10μL，加超纯水至20μL。反应条件：95℃预变性20 min，PCR反应，95℃变性10s，61℃退火20 s，72℃延伸25 s，共40个循环。CD11b引物序列由上海生工生物公司合成，其引物序列Forward：5'-CTGCTCCTCAAGGTCGTTGT-3'；Reverse：5'-AGATGGCGTACTTCACAGGC-3'。

1.6 Western blot检测给药第21 d后，取大鼠左侧脊髓腰膨大（L4~L6），裂解组织（RIPA裂解液），应用BCA测定蛋白浓度并进行蛋白定量至2μg·μL-1，定量后99℃煮5 min。应用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样本（80~100 V），电泳结束后恒流转膜。用5%的脱脂牛奶室温封闭1 h并于4℃摇床孵育一抗过夜。第2 d，用TBST洗3×5 min后室温孵育二抗1 h，再用TBST洗3×10 min，然后用AI600显影。

1.7 统计学方法应用统计作图软件Prism 8.0进行数据分析，结果以平均值±标准差表示，两组间比较应用t检验，多组间的两两比较采用单因素方差分析（one-way，ANOVA），然后进行Newman-Keul检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICTF对CFA大鼠脊髓CD11b的mRNA和蛋白表达的影响如图1所示，与Ctrl组比较，经CFA造模后，大鼠CD11b的mRNA和蛋白表达水平显著上调（P＜0.01），经ICTF治疗后CD11b的mRNA和蛋白表达水平显著下调（P＜0.001）。

图1 ICTF对CFA大鼠脊髓CD11b的mRNA和蛋白表达的作用

2.2 鞘内给予α-Bgtx对ICTF作用于大鼠脊髓CD11b蛋白表达的影响如图2所示，与CFA＋ICTF＋PBS组比较，鞘内注射α-Bgtx组大鼠的CD11b蛋白表达水平明显升高（P＜0.001）。

图2 鞘内给予α-Bgtx对ICTF作用于大鼠脊髓CD11b蛋白表达的影响

3 讨论

文献报道，完全弗氏佐剂是由非代谢油和高温灭活的结核分枝杆菌制成［11］，可诱导长时程的伤害性感受，其特征是胶质细胞激活、P物质和大量促炎介质的释放［6］。小胶质细胞是中枢神经系统中关键的免疫细胞，其参与炎症的发生发展过程。小胶质细胞介导的神经炎症在炎性痛的致病进程中发挥着关键作用。小胶质细胞一旦受到周围组织损伤或神经损伤的刺激后，会分泌大量的促炎细胞因子，如IL-6、TNF-α和IL-1β［12］。而CFA可激活脊髓小胶质细胞释放大量促炎细胞因子［6］，这些促炎细胞因子可通过多种信号通路调节痛觉过敏或异位痛［13］。有研究显示，CFA可上调脊髓CD11b的蛋白表达水平［14］，这与本实验的结果相一致，我们发现与对照组相比，CFA可显著升高大鼠脊髓CD11b的mRNA和蛋白表达水平。提示脊髓小胶质细胞的激化参与了CFA诱导的慢性炎性痛。同时，抑制脊髓小胶质细胞的激活可减少促炎细胞因子的释放进而有效缓解CFA引起的机械痛敏［15］。

外周和中枢神经系统的神经炎症在慢性炎性痛的发生和维持中起着关键作用。周围神经系统的神经炎症是由施万细胞和卫星胶质细胞的激活引起的，而中枢神经系统的神经炎症是由包括小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及免疫细胞的激活所引发［16］。越来越多的证据表明，脊髓小胶质细胞通过释放促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和BDNF等参与慢性痛的发生发展过程［17］。文献报道，胆碱能抗炎途径（Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）是一种神经免疫调节途径，乙酰胆碱经迷走神经释放并激活α7nAChR进而抑制促炎性细胞因子的合成和释放，最终以反馈的方式调节局部或全身炎症反应［18］。α7nAChR存在于脊髓和疼痛传导通路中［19-20］，比如其在小胶质细胞、免疫细胞、神经元和星形胶质细胞有大量表达［21-23］。但是，α7nAChR敲除或使用特异性拮抗剂可阻断或消除迷走神经刺激的抗炎作用［24］。

三氟淫羊藿素为淫羊藿素的衍生物，它是一种黄酮类单体化合物，与植物雌激素结构相似［4］。有研究显示，植物雌激素可缓解部分神经损伤大鼠的机械痛敏［3］。此外，植物雌激素是一种具有抗神经炎症作用的神经保护剂［25］，植物雌激素可以替代雌激素维持大脑稳态［26］。植物雌激素的这种机制不仅通过抑制具有促炎特性的小胶质细胞M1极性激活，还通过诱导具有抗炎特性的小胶质细胞M2激活来实现［26］。总之，植物雌激素可通过抑制小胶质细胞的激活进而抑制神经炎症［27］。我们前期工作发现三氟淫羊藿素可缓解CFA诱导的慢性炎性痛的机械和热痛敏行为，因此，我们选择其有效剂量为3 mg·kg-1的三氟淫羊藿素来进一步探讨其可能的作用机制。结果显示，给予ICTF于CFA大鼠后，脊髓CD11b的蛋白表达水平明显下降。提示ICTF可能通过抑制小胶质细胞的激活来缓解慢性炎性痛。有研究表明，黄酮类化合物可通过激活α7nAChR发挥抗炎作用［28］，基于三氟淫羊藿素具有黄酮类单体化合物的特点。接着我们应用α7nAChR的抑制剂α-Bgtx进行干预实验，结果发现α-Bgtx可明显反转ICTF对小胶质细胞激活的特异性标记物CD11b蛋白表达的下调作用。提示ICTF可能通过α7nAChR抑制小胶质细胞的激活发挥缓解CFA诱导慢性炎性痛的作用。

综上所述，虽然慢性炎性痛的发病机制比较复杂，但抑制小胶质细胞的激活可能是治疗慢性炎性痛的途径之一。目前临床上治疗慢性炎性痛多以阿片类药物和非甾体抗炎药物为主。然而，长期使用阿片类药物会出现依赖性、上瘾性和戒断反应等［29］，而且非甾体抗炎药还会增加住院患者心力衰竭和死亡的风险［30］。因此，寻求一种安全有效且不良反应少的治疗慢性炎性痛的药物至关重要。我们研究发现，ICTF可能通过α7nAChR抑制小胶质细胞的激活缓解CFA诱导的慢性炎性痛，这将为慢性炎性痛的临床治疗提供新药物和新思路。