漆黄素抗骨关节炎作用机制的分子对接研究

郭小华，叶民珠，吴龙火

（赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是在全球盛行的一种关节退行性疾病，且随着老龄化发展及不健康饮食导致的肥胖人群的增加，发病率不断攀升，因此也被称为老年性关节炎或肥胖性关节炎［1-2］。骨关节炎的临床表现以关节肿痛、骨质增生、关节功能受限等居多［3］，其发病原因及发病机制尚不很明确，多数报道称可能与年龄、肥胖、遗传或过度劳累有关［4］。近年来，对骨关节炎的发病机制研究逐渐进入分子水平，很多炎症靶点如TNF-α、IL-1、NF-κB等被认为与骨关节炎的发生、发展密切相关［5-7］。郑文浩等［8］研究发现，中药活性成分漆黄素（Fisetin，非瑟酮）能够抑制脂多糖（LPS）诱导的多种炎症因子的过度表达，表现出很强的抗骨关节炎活性。

漆黄素（3，7，3’，4’-四羟基黄酮）是一种植物中天然存在的多酚黄酮类化合物，主要从漆科植物漆树、木蜡树和黄栌中提取分离得到，也存在于一些蔬菜、水果中［9-12］。漆黄素药理作用广泛，主要表现出抗氧化、抗炎、降糖、抗肿瘤等［13］，在抗炎作用方面的研究较多、较深入［14-16］。有研究表明，漆黄素可降低NO、PGE2、TNF-α等10个炎症因子的表达，抑制IL-1β诱导的炎症反应，从而阻止骨关节炎的发生、发展［8］。

然而，漆黄素产生抗骨关节炎作用时，降低炎症因子表达的具体作用机制如何？对各种炎症因子的抑制作用是否具有选择性？这些问题目前有待于进一步深入研究。本课题组之前探讨过黄酮类化合物通过抑制炎症因子表达产生抗骨关节炎的作用［17］，基于此，本文尝试用分子对接的方法，模拟漆黄素与NO等10个抗骨关节炎靶蛋白的相互作用，探讨漆黄素抗骨关节炎可能的作用机制，并结合漆黄素与靶蛋白的结合模式，推测漆黄素结构修饰的方向，为获得活性更高的漆黄素衍生物提供一定思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料AutoDock 4.2、AutoDock Tools 1.5.4软件可从官网（http：//autodock.scripps.edu/）下载，各靶蛋白（受体）的晶体结构可从PDB数据库中下载，其他应用软件及在线程序均可在其各自官网下载或直接应用，所需软件、在线程序及其用途见表1。

表1 对接实验使用的软件、在线程序及用途

1.2 实验方法

1.2.1 分子对接计算前配体和受体的预处理

1.2.1.1 配体的选取及预处理本文以漆黄素及10个抗骨关节炎靶蛋白（受体）中的原始配体为分子对接实验的配体（化合物1~11，图1）。先将11个配体的平面结构在线转化成三维结构，并在Chimera程序中将其分别置于相应对接受体的活性位点处，保存为pdb格式文件。再将此pdb格式文件的配体分子置于AutoDockTools（ADT）软件中，加上电荷和非极性氢，保存为pdbqt格式文件。

图1 漆黄素等11个配体化合物的化学结构

1.2.1.2 受体的选取及预处理从Brookheaven蛋白数据库中获取10个受体的晶体结构，并在Chimera程序中将受体中的水分子、原始配体等剔除，保存为pdb格式文件。再将此pdb格式文件的受体分子置于ADT软件中加上电荷和非极性氢，保存为pdbqt格式文件，如受体中有金属离子缺少电荷，可在Python 2.5.2软件中为其添加电荷并保存。

1.2.2 分子对接实验运算在ADT软件中，以配体为中心，设置配体分子和受体分子的网格大小（60Å×60Å×60Å），配体构象搜索过程使用半经验打分函数和拉马克遗传算法，算法对接的轮数设为100，其他参数保持默认值，运行AutoGrid生成必要的图像文件，最后再运行ADT中的autogrid和autodock对接程序，进行分子对接计算实验。

1.2.3 分子对接实验结果处理以估计抑制常数（Inhibit constant，Ki）和结合自由能（Binding energy，△Gbind）为参考指标，以各受体中的原始配体为对照，比较漆黄素与各受体分子对接的Ki值和△Gbind值，并从最佳构象上分析各对接配体与相应受体的结合模式，从分子水平探讨它们的结合作用。

2 结果

漆黄素与10个受体的原始配体与对应受体的分子对接数据Ki值和△Gbind值见表2。△Gbind、Ki越小，说明与受体的结合能力越强，对受体的虚拟抑制活性越强。从对接数据上看，漆黄素与各受体对接的Ki值均达到了微摩尔级水平，表现出对各受体不同程度的抑制作用。

表2 配体分子与各靶点分子对接实验的对接数据

3 讨论

3.1 分子对接数据分析由表2的对接数据可以看出，漆黄素与NO、IL-6、TNF-α及MMP-3等4个受体对接的Ki值均小于相应原始配体重对接的Ki值，尤其是与TNF-α受体的对接Ki值最小，为7.10×10-2μmol·L-1，远小于相应原始配体的对接Ki值（5.27×10-1μmol·L-1），表现出对该受体很强的虚拟抑制活性。漆黄素与PGE2等6个受体分子对接Ki值均高于相应原始配体的对接Ki值，特别是与iNOS受体对接的Ki值为2.54μmol·L-1，是其相应原始配体对接Ki值（7.16×10-2μmol·L-1）的35倍，对iNOS受体的虚拟抑制活性要明显弱于相应的原始配体。

从对接数据上看，漆黄素与TNF-α等4个受体的结合作用，要强于其与iNOS等6个受体结合作用。由此可见，漆黄素对LPS诱导的多种炎症因子表达的抑制作用有一定的选择性。TNF-α等蛋白可能是漆黄素发挥抗骨关节炎的主要作用靶点。

为探讨漆黄素对受体的选择性，我们将从分子对接构象上比较分析漆黄素与TNF-α受体和iNOS受体结合作用的强弱，并尝试提出漆黄素可能的结构修饰方向，以期获得抗骨关节炎活性更高的漆黄素衍生物。

3.2 分子对接构象分析

3.2.1 漆黄素、原始配体6与TNF-α受体对接构象分析TNF-α是肿瘤坏死因子中的一种类型，可促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症反应的发生。从晶体结构可看出，TNF-α受体的活性位点是由LEU350、HIS409、TYR436、GLU398等十几个氨基酸构成的一条狭长的活性腔。该活性腔有3个活性口袋，由GLY349、HIS409、HIS415等氨基酸构成的亲水性口袋，和分别由VAL440、LEU401、GLU398及由TYR436、PRO437、ALA439等氨基酸构成的2个疏水性口袋（疏水性口袋1和疏水性口袋2）（图2）。

分子对接实验构象显示（图2），漆黄素和原始配体6两个分子均横跨了TNF-α受体的整个活性腔，并占据了活性腔中亲水性口袋和疏水性口袋1。

图2 漆黄素、原始配体6与TNF-α受体对接最佳构象图

漆黄素的邻二酚羟基结构和原始配体6的羟胺结构嵌入到了活性腔的亲水性口袋，其中漆黄素的邻二酚羟基与亲水性口袋中的关键氨基酸GLY349形成了两个氢键相互作用力，原始配体6的羟胺与亲水性口袋中的关键氨基酸HIS415形成了一个氢键相互作用力。

漆黄素的黄酮母核结构及原始配体6的丁炔氧基部分则伸入到活性腔中的疏水性口袋1，形成一定的疏水相互作用力，同时漆黄素黄酮母核上的酚羟基还与疏水性口袋1中的GLU398氨基酸形成了一个氢键相互作用力。

漆黄素和原始配体6在空间上能够与TNF-α受体相互匹配，对接构象稳定，并通过与活性口袋的关键氨基酸形成氢键等相互作用力，表现出与TNF-α受体很强的结合能力。与分子对接数据相吻合，表现出较强的抗骨关节炎的虚拟活性。不足的是，漆黄素和原始配体6在空间上均未能靠近疏水性口袋2。

3.2.2 漆黄素、原始配体7与iNOS受体对接构象分析蛋白晶体结构显示，iNOS受体的活性位点由一条细长的活性腔和一个圆形活性口袋组成。其中 细 长 的 活 性 腔 由MET349、TYR483、CYS194、PHE363等氨基酸构成，而圆形活性口袋则由PHE363、ALA345、GLU257等氨基酸构成（图3）。

图3 漆黄素、原始配体7与iNOS受体对接最佳构象图

从分子对接数据我们已知，漆黄素与iNOS受体的对接数据劣于原始配体7，原因可能是类似平面结构的漆黄素在与iNOS受体结合时，只能占据活性位点的细长活性腔，而不能伸入到圆形活性口袋（图3）。另外，漆黄素母核中苯环结构有一定的疏水性，可能导致苯环上的酚羟基很难与活性腔中的一些极性氨基酸形成氢键，仅黄酮母核上的羰基氧与CYS194氨基酸形成了一个氢键相互作用力。

与漆黄素不同的是，多环相连接的原始配体7两端的极性基团分别与活性腔中的TRP188和TYR483氨基酸形成了两个氢键相互作用力。此外，原始配体7扭曲的空间结构还使得中间连接的哌啶结构向iNOS受体的圆形活性口袋靠近，虽未完全占据整个活性口袋，但仍形成了一定的相互作用力，导致原始配体7与iNOS受体的结合作用要明显强于漆黄素，分子对接数据明显优于漆黄素也在情理之中。

3.2.3 漆黄素潜在的结构修饰方向探讨从漆黄素与TNF-α受体和iNOS受体的分子对接构象分析，漆黄素无论是与结合作用强的TNF-α受体，还是与虚拟活性较差的iNOS受体对接时，都未能完全匹配占据相应蛋白的所有活性位点。漆黄素与TNF-α受体结合时，没有占据疏水性口袋2，与iNOS受体对接时，远离了圆形活性口袋，这都表明漆黄素在抗骨关节炎活性方面有结构修饰的空间，本课题组在这方面做了一些尝试。

根据漆黄素与TNF-α受体和iNOS受体的相互作用和结合方式，我们提出在漆黄素黄酮母核的3位羟基上引入芳香性基团或极性取代芳香性基团（图4），可增强漆黄素与周边氨基酸的共轭效应或疏水作用力，提高漆黄素与相应蛋白的结合能力，以提高其抗骨关节炎活性。通过分子对接实验，我们这一设想也得到了验证。合成所设计的漆黄素衍生物，并进行药理实验，是我们下一步的研究任务。

图4 漆黄素与TNF-α受体、iNOS受体结合时潜在的结构修饰方向示意图

4 结 论

分子对接的Ki值和△Gbind值是分子对接技术对配体与受体对接结果最直接的评价，Ki值和△Gbind值越小，配体与受体的结合作用越强，配体对受体的虚拟抑制活性越高。分子对接构象可更直观地体现配体与受体的结合模式，对接构象越稳定，配体与受体结合越牢固。

本研究以原始配体为对照，模拟了漆黄素与10个抗骨关节炎靶蛋白的相互作用。结果表明，漆黄素对抗骨关节炎靶点的结合作用有一定的选择性。漆黄素与TNF-α受体对接的Ki值和△Gbind值最小，且远小于相应原始配体的Ki值和△Gbind值。分子对接实验时，漆黄素在空间上与TNF-α受体的活性位点相互匹配，其结构中的3个酚羟基均与受体活性位点中的关键氨基酸形成了氢键相互作用力，分子对接构象稳定，表现出与TNF-α受体很强的结合作用及很强的虚拟抑制活性。

漆黄素与iNOS受体的对接数据不理想，对接Ki值是其相应原始配体的35倍，漆黄素与iNOS受体分子对接时，只占据了iNOS受体的细长活性腔，对圆形活性口袋作用较弱。漆黄素对iNOS等受体的虚拟抑制活性弱于其相应原始配体。

漆黄素与TNF-α受体的对接数据最优，对接构象最稳定，TNF-α可能是漆黄素发挥抗骨关节炎作用的主要靶点。在漆黄素3位羟基引入芳香性取代基团，有利于增强漆黄素与相应受体的结合能力，是漆黄素提高其抗骨关节炎活性的主要结构修饰位点。本研究借助分子对接软件模拟漆黄素与靶蛋白的作用模式，为中药活性成分的抗炎作用机制及结构修饰提供了新的思路。